Алгоритм определения подлинности биомедицинских клеточных препаратов, содержащих мезенхимальные стволовые клетки

Применение мезенхимальных стволовых клеток (МСК), обладающих выраженной иммуномодулирующей активностью, – перспективное направление развития биомедицинских клеточных препаратов (БМКП). В онкогематологии использование БМКП, содержащих МСК, направлено на поддержку кроветворения при котрансплантации с гемопоэтическими стволовыми клетками (ГСК) и подавление иммунных конфликтов при аллогенной неродственной трансплантации и тяжелых аутоиммунных процессах. Обязательный этап регистрации БМКП – подтверждение подлинности клеточной линии МСК, включающий в себя установление морфологических характеристик, оценку экспрессии специфических маркеров и белков, подтверждение генетической стабильности клеточной линии в процессе культивирования. Определение маркеров генетической стабильности возможно с использованием различных методик, однако, согласно рекомендациям American National Standardization Institute, эталоном является анализ коротких тандемных повторов (STR-анализ). Цель исследования – разработка алгоритма определения подлинности БМКП, содержащих МСК, включающего в себя STR-анализ. Материал и методы. Идентификацию МСК в БМКП проводили по наличию иммунологических маркеров и адгезии к пластику веретеновидных клеток. Количество жизнеспособных клеток подсчитывали в камере Горяева. Иммунофенотипические характеристики МСК определяли методом проточной цитометрии. Уровень продукции специфических белков оценивали с помощью иммуноферментного анализа. Маркеры генетической стабильности выявляли методом STR-анализа. Результаты и их обсуждение. Методики апробированы в трех повторностях для десяти образцов БМКП для подтверждения воспроизводимости и достоверности получаемых результатов. Разработанный алгоритм определения подлинности БМКП имеет высокую точность, так как включает в себя методику STR-анализа, позволяющего идентифицировать 19 полиморфных STR-маркеров, расположенных на разных аллелях. Использование способа позволит производителям БМКП проходить процедуру государственной регистрации препаратов.

1. Звонков Е.Е., Королева Д.А., Габеева Н.Г., Гаврилина О.А., Федорова С.Ю., Губкин А.В., Ковригина А.М., Яцык Г.А., Клясова Г.А., Савенко Т.А., Савченко В.Г. Высокодозная химиотерапия первичной диффузной В-крупноклеточной лимфомы центральной нервной системы. Промежуточные результаты протокола CNS-2015. Гематол. и трансфузиол. 2019;64(4): 447–461. doi:10.35754/0234-5730-2019-64-4-447-461

2. Реакция «трансплантат против хозяина». Режим доступа: https://www.podari-zhizn.ru/main/node/7769 (дата обращения: 05/06/2022)

3. Приказ Минздрава России от 19.01.2017 № 14н «Об утверждении формы спецификации набиомедицинский клеточный продукт». Режим доступа: http://www.consultant.ru/document/cons_doc_LAW_212714/

4. Мельникова Е.В., Рачинская О.А., Трусов Г.А., Хорольский М.Д., Семенова И.С., Терешкина Н.В., Меркулов В.А. Обоснование методических подходов к экспертной оценке подлинности биомедицинских клеточных продуктов. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2019;19(1):28–38. doi: 10.30895/2221-996X-2019-19-1-28-38

5. SME Workshop on CMC of Biological Medicinal Products. EMA London. CMC ISSUES for Cell Based ATMP. Available at: https://www.ema.europa.eu/en/documents/presentation/presentation-sme-workshop-cmc-biological-medicinal-products-margarida-menezes-ferreira_en.pdf

6. Q5D Quality of Biotechnological/Biological Products: Derivation and Characterization of Cell Substrates Used for Production of Biotechnological/Biological Products. Available at: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/q5d-quality-biotechnologicalbiological-products-derivation-and-characterization-cell-substrates-used

7. Recommendations for the evaluation of animal cell cultures as substrates for the manufacture of biological medicinal products and for the characterization of cell banks (WHO/BS/10.2132). Available at: https://gxpacademy.org/upload/iblock/8df/8df32e5342a440d38ed3e5b0fbec42ca.pdf

8. Однонуклеотидные полиморфизмы в судебной генетике: методы детекции SNP Available at: https://testgen.ru/ru/nauchnyie-issledovaniya/stati-i-spravochnye-materialy/odnonukleotidnye-polimorfizmy-v-sudebnoy-genetike-metody-detektsii-snp/

9. SME Workshop on CMC of Biological Medicinal Products. EMA London 14–16.04.2015. CMC ISSUES for Cell Based ATMP. Available at: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Presentation/2015/05/WC500187353.pdf

10. American Type Culture Collection Standards Development Organization Workgroup ASN-0002. Cell line misidentification: the beginning of the end. Nat. Rev. Cancer. 2010;10(6):441–448. doi: 10.1038/nrc2852/