Определение механизма кальцификации неоинтимы при атеросклерозе при помощи элементного анализа

Введение. Формирование атеросклеротических бляшек в большинстве случаев сопровождается их кальцификацией, однако патобиохимические механизмы ее инициации и прогрессирования остаются неясными. В частности, неизвестно, как именно образуется макрокальцификат – путем постепенного роста от центра к периферии или посредством последовательного слияния микрокальцификатов. Цель исследования – изучить пространственно-временные аспекты химической трансформации фосфата кальция в атеросклеротических бляшках для оценки основных гипотез механизма созревания кальцификатов в неоинтиме. Материал и методы. Материалом исследования служили 20 кальцинированных атеросклеротических бляшек, удаленных в процессе каротидной эндартерэктомии. После фиксации в формалине, постфиксации и окрашивания тетраоксидом осмия, обезвоживания и окрашивания уранилацетатом бляшки заключали в эпоксидную смолу с дальнейшей шлифовкой, полировкой и контрастированием цитратом свинца. После напыления углеродом визуализировали микроструктуру бляшек методом сканирующей электронной микроскопии в обратнорассеянных электронах. Элементный анализ кальцификатов проводили при помощи энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии также в режиме обратнорассеянных электронов в условиях высокого вакуума при ускоряющем напряжении 20 кВ. Анализ выполняли на 11 радиально расположенных внутри кальцификата и четырех контрольных точках на различном удалении от кальцификата. Результаты. Как атеросклеротические бляшки, так и участки одной и той же бляшки различались по соотношению содержания кальция и фосфора в кальцификатах. Корреляционный анализ выявил статистически значимую связь между величиной данного соотношения на периферии и в центре кальцификата. Участки кальцификатов с разной электронной плотностью также имели различное соотношение содержания кальция и фосфора, однако убедительной корреляции данных показателей не выявлено. Заключение. Корреляция соотношения содержания кальция и фосфора в центре и на периферии кальцификата свидетельствует о его созревании от центра к периферии, а не об оссификации (слиянии небольших очагов кальцификации в один крупный).

атеросклероз, кальцификация, минерализация, элементный анализ, фосфат кальция, гидроксиапатит

1. Shi X., Gao J., Lv Q., Cai H., Wang F., Ye R., Liu X. Calcification in atherosclerotic plaque vulnerability: Friend or foe? Front. Physiol. 2020; 11: 56. doi: 10.3389/fphys.2020.00056

2. Kelly-Arnold A., Maldonado N., Laudier D., Aikawa E., Cardoso L., Weinbaum S. Revised microcalcification hypothesis for fibrous cap rupture in human coronary arteries. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2013; 110 (26): 10741–10746. doi: 10.1073/pnas.1308814110

3. Petsophonsakul P., Furmanik M., Forsythe R., Dweck M., Schurink G.W., Natour E., Reutelingsperger C., Jacobs M., Mees B., Schurgers L. Role of vascular smooth muscle cell phenotypic switching and calcification in aortic aneurysm formation. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2019; 39 (7): 1351–1368. doi: 10.1161/ATVBAHA.119.312787

4. Vengrenyuk Y., Carlier S., Xanthos S., Cardoso L., Ganatos P., Virmani R., Einav S., Gilchrist L., Weinbaum S. A hypothesis for vulnerable plaque rupture due to stress-induced debonding around cellular microcalcifications in thin fibrous caps. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006; 103 (40): 14678–14683. doi: 10.1073/pnas.0606310103

5. Zhan Y., Zhang Y., Hou J., Lin G., Yu B. Relation between superficial calcifications and plaque rupture: An optical coherence tomography study. Can. J. Cardiol. 2017; 33 (8): 991–997. doi: 10.1016/j.cjca.2017.05.003

6. Akers E.J., Nicholls S.J., di Bartolo B.A. Plaque calcification: Do lipoproteins have a role? Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2019; 39 (10): 1902–1910. doi: 10.1161/ATVBAHA.119.311574

7. Otsuka F., Sakakura K., Yahagi K., Joner M., Virmani R. Has our understanding of calcification in human coronary atherosclerosis progressed? Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2014; 34 (4): 724–736. doi: 10.1161/ATVBAHA.113.302642

8. Bäck M., Aranyi T., Cancela M.L., Carracedo M., Conceição N., Leftheriotis G., Macrae V., Martin L., Nitschke Y., Pasch A., Quaglino D., Rutsch F., Shanahan C., Sorribas V., Szeri F., Valdivielso P., Vanakker O., Kempf H. Endogenous calcification inhibitors in the prevention of vascular calcification: A consensus statement from the COST action EuroSoftCalcNet. Front. Cardiovasc. Med. 2019; 5: 196. doi: 10.3389/fcvm.2018.00196

9. Roijers R.B., Debernardi N., Cleutjens J.P., Schurgers L.J., Mutsaers P.H., van der Vusse G.J. Microcalcifications in early intimal lesions of atherosclerotic human coronary arteries. Am. J. Pathol. 2011; 178 (6): 2879–2887. doi: 10.1016/j.ajpath.2011.02.004

10. Carino A., Ludwig C., Cervellino A., Müller E., Testino A. Formation and transformation of calcium phosphate phases under biologically relevant conditions: Experiments and modelling. Acta Biomater. 2018; 74: 478–488. doi: 10.1016/j.actbio.2018.05.027

11. Chen J., Peacock J.R., Branch J., Merryman W.D. Biophysical analysis of dystrophic and osteogenic models of valvular calcification. J. Biomech. Eng. 2015; 137 (2): 020903. doi: 10.1115/1.4029115

12. Hutcheson J.D., Goettsch C., Bertazzo S., Maldonado N., Ruiz J.L., Goh W., Yabusaki K., Faits T., Bouten C., Franck G., Quillard T., Libby P., Aikawa M., Weinbaum S., Aikawa E. Genesis and growth of extracellular-vesicle-derived microcalcification in atherosclerotic plaques. Nat. Mater. 2016; 15 (3): 335–343. doi: 10.1038/nmat4519

13. Burgmaier M., Milzi A., Dettori R., Burgmaier K., Marx N., Reith S. Co-localization of plaque macrophages with calcification is associated with a more vulnerable plaque phenotype and a greater calcification burden in coronary target segments as determined by OCT. PLoS One. 2018; 13 (10): e0205984. doi: 10.1371/journal.pone.0205984

14. Fuery M.A., Liang L., Kaplan F.S., Mohler E.R 3rd. Vascular ossification: Pathology, mechanisms, and clinical implications. Bone. 2018; 109: 28–34. doi: 10.1016/j.bone.2017.07.006

15. Pettenazzo E., Deiwick M., Thiene G., Molin G., Glasmacher B., Martignago F., Bottio T., Reul H., Valente M. Dynamic in vitro calcification of bioprosthetic porcine valves evidence of apatite crystallization. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2001; 121 (3): 500–509. doi: 10.1067/mtc.2001.112464

16. Murungi J.I., Thiam S., Tracy R.E., Robinson J.W., Warner I.M. Elemental analysis of soft plaque and calcified plaque deposits from human coronary arteries and aorta. J. Environ. Sci. Health. A. Tox. Hazard. Subst. Environ. Eng. 2004; 39 (6): 1487–1496. doi:10.1081/ese-120037848

17. Balachandran K., Sucosky P., Jo H., Yoganathan A.P. Elevated cyclic stretch induces aortic valve calcification in a bone morphogenic protein-dependent manner. Am. J. Pathol. 2010; 177 (1): 49–57. doi: 10.2353/ajpath.2010.090631

18. Mikroulis D., Mavrilas D., Kapolos J., Koutsoukos P.G., Lolas C. Physicochemical and microscopical study of calcific deposits from natural and bioprosthetic heart valves. Comparison and implications for mineralization mechanism. J. Mater. Sci. Mater. Med. 2002; 13 (9): 885–889. doi: 10.1023/a:1016556514203

19. Cheng C.L., Chang H.H., Huang P.J., Wang W.C., Lin S.Y. Ex vivo assessment of valve thickness/ calcification of patients with calcific aortic stenosis in relation to in vivo clinical outcomes. J. Mech. Behav. Biomed. Mater. 2017; 74: 324–332. doi: 10.1016/j.jmbbm.2017.06.020

20. Cottignoli V., Relucenti M., Agrosì G., Cavarretta E., Familiari G., Salvador L., Maras A. Biological niches within human calcified aortic valves: towards understanding of the pathological biomineralization process. Biomed. Res. Int. 2015; 2015: 542687. doi: 10.1155/2015/542687

21. Mangialardo S., Cottignoli V., Cavarretta E., Salvador L., Postorino P., Maras A. Pathological biominerals: raman and infrared studies of bioapatite deposits in human heart valves. Appl. Spectrosc. 2012; 66 (10): 1121–1127. doi: 10.1366/12-06606

22. Cottignoli V., Cavarretta E., Salvador L., Valfré C., Maras A. Morphological and chemical study of pathological deposits in human aortic and mitral valve stenosis: a biomineralogical contribution. Patholog. Res. Int. 2015; 2015: 342984. doi: 10.1155/2015/342984