Применение аполипопротеина А-I в качестве транспортной формы гена зеленого флуоресцирующего белка GFP в гепатоциты крыс

Целью настоящего исследования явилось изучение возможности использования аполипопротеина А-I (апо А-I) в качестве транспортной формы гена зеленого флуоресцирующего белка (GFP) в гепатоциты крыс.
Материал и методы. В качестве модели использовали культуру выделенных гепатоцитов крыс. Конъюгат апо А-I с флуоресцеина изотиоцианатом (ФИТЦ) получали путем инкубирования белка апо А-I с ФИТЦ в карбонатном буфере рН 9,5 в соотношении 12,5 мкг ФИТЦ на 1 мг белка. Плазмиды для трансфекции pE-GAG со встроенным геном GFP обогащали в промоторной части цис-элементами типа CC(GCC)3-5 для усиления комплексообразования с апо А-I. Для визуального анализа флуоресценции клеток использовали инвертированный флуоресцентный микроскоп.
Результаты и их обсуждение. В работе представлены доказательства проникновения путем рецептор-опосредованного эндоцитоза ФИТЦ-меченного апо А-I в цитоплазму и ядра гепатоцитов крыс. На этом основании предложена попытка использовать апо А-I в качестве средства адресной доставки плазмидной ДНК со встроенным геном белка GFP в клетку. Согласно результатам флуоресцентной микроскопии, использование апо А-I в качестве трансфицирующего агента плазмидной ДНК приводило к накоплению белка GFP в цитоплазме гепатоцитов. Экспрессии гена GFP и накопления флуоресцирующего белка в отсутствие апо А-I не наблюдалось.
Заключение. Полученный результат может свидетельствовать о доставке гена GFP в ядерный аппарат клетки, его экспрессии и синтезе белка GFP.

1. Kouraklis G. Gene therapy for cancer: From the laboratory to the patient. Dig. Dis. Sci. 2000;45(6):1045–1052. doi: 10.1023/a:1005592309466

2. Felgner P.L., Gadek T.R., Holm M., Roman R., Chan H.W., Wenz M., Northrop J.P., Ringold G.M., Danielsen M. Lipofection: A highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1987;84(21):7413–7417. doi: 10.1073/pnas.84.21.7413

3. Balicki D., Beutler E. Gene therapy of human disease. Medicine (Baltimore). 2002;81(1):69–86. doi: 10.1097/00005792-200201000-00005

4. Jung H.J., Hwang D.S., Wei Q.D., Cha H.J. Carassius auratus – originated recombinant histone H1 C-terminal peptide as gene delivery material. Biotechnol. Prog. 2008;24(1):17–22. doi: 10.1021/bp070069b

5. Поляков Л.М., Панин Л.Е. Липопротеины высокой плотности и аполипопротеин А-I: регуляторная роль и новые терапевтические стратегии лечения атеросклероза. Атеросклероз. 2013;9(1):42–53.

6. Суменкова Д.В., Поляков Л.М., Панин Л.Е. Липопротеины как транспортная форма внеклеточной ДНК. Бюл. эксперим. биол. и мед. 2012;154(11):577–579.

7. Kim S.I., Shin D., Lee H., Ahn B.Y., Yoon Y., Kim M. Targeted delivery of siRNA against hepatitis C virus by apolipoprotein A-I-bound cationic liposomes. J. Hepatol. 2009;50(3):479–488. doi: 10.1016/j.jhep.2008.10.029

8. Michell D.L., Vickers K.C. Lipoprotein carriers of microRNAs. Biochim. Biophys. Acta. 2016;(12 Pt B): 2069–2074. doi: 10.1016/j.bbalip.2016.01.011

9. Kratzer I., Werning K., Panzenboeck U., Bernhart E., Reicher H., Wronski R., Windisch M., Hammer A., Malle E., Zimmer A., Sattler W. Apolipoprotein A-I coating of protamine-oligonucleotide nanoparticles increases particle uptake and transcytosis in an in vitro model of the blood-brain barrier. J. Control. Release. 2007;117(3):301–311. doi: 10.1016/j.jconrel.2006.11.020

10. Поляков Л.М., Суменкова Д.В., Князев Р.А., Панин Л.Е. Анализ взаимодействия липопротеинов со стероидными гормонами. Биомед. химия. 2011;57(3):308–313. doi:10.18097/pbmc20115703308

11. Panin L.E., Russkikh G.S., Polyakov L.M. Detection of apolipoprotein A-I, B, and E immunoreactivity in the nuclei of various rat tissue cells. Biochemistry (Mosc.). 2000;65(12):1419–1423. doi: 10.1023/a:1002861008363

12. Panin L., Gimautdinova O., Kuznetsov P., Tuzikov F. The mechanism of interacting biologically active complexes dehydroepiandrosterone- or tetrahydrocortisol- apolipoprotein A-I with DNA and their role in enhancement of gene expression and protein biosynthe-sis in hepatocytes. Curr. Chem. Biol. 2011;5(1):9–16. doi: 10.2174/2212796811105010009

13. Степаненко О.В., Верхуша В.В., Кузнецова И.М., Туроверов К.К. Флуоресцентные белки: физико-химические свойства и использование в клеточной биологии. Цитология. 2007;49(5):395–420.

14. Zhang H., Forman H.J. Signaling by 4-hydroxy-2-nonenal: Exposure protocols, target selectivity and degradation. Arch. Biochem. Biophys. 2017;617:145–154. doi: 10.1016/j.abb.2016.11.003