Поляков Лев Михайлович, д.м.н., проф.
630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2
Lev M. Polyakov, doctor of medical sciences, professor
630117, Novosibirsk, Timakova st., 2
Суменкова Дина Валерьевна, д.б.н.
630091, г. Новосибирск, Красный просп., 52
Dina V. Sumenkova, doctor of biological sciences
630091, Novosibirsk, Krasny ave., 52
Котова Мария Владимировна
630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2
Mariya V. Kotova
630117, Novosibirsk, Timakova st., 2
Трифонова Наталия Викторовна
630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2
Natalia V. Trifonova
630117, Novosibirsk, Timakova st., 2
Князев Роман Александрович, к.б.н.
630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2
Roman A. Knyazev, candidate of biological sciences
630117, Novosibirsk, Timakova st., 2
Целью настоящего исследования явилось изучение возможности использования аполипопротеина А-I (апо А-I) в качестве транспортной формы гена зеленого флуоресцирующего белка (GFP) в гепатоциты крыс.Материал и методы. В качестве модели использовали культуру выделенных гепатоцитов крыс. Конъюгат апо А-I с флуоресцеина изотиоцианатом (ФИТЦ) получали путем инкубирования белка апо А-I с ФИТЦ в карбонатном буфере рН 9,5 в соотношении 12,5 мкг ФИТЦ на 1 мг белка. Плазмиды для трансфекции pE-GAG со встроенным геном GFP обогащали в промоторной части цис-элементами типа CC(GCC)3-5 для усиления комплексообразования с апо А-I. Для визуального анализа флуоресценции клеток использовали инвертированный флуоресцентный микроскоп.Результаты и их обсуждение. В работе представлены доказательства проникновения путем рецептор-опосредованного эндоцитоза ФИТЦ-меченного апо А-I в цитоплазму и ядра гепатоцитов крыс. На этом основании предложена попытка использовать апо А-I в качестве средства адресной доставки плазмидной ДНК со встроенным геном белка GFP в клетку. Согласно результатам флуоресцентной микроскопии, использование апо А-I в качестве трансфицирующего агента плазмидной ДНК приводило к накоплению белка GFP в цитоплазме гепатоцитов. Экспрессии гена GFP и накопления флуоресцирующего белка в отсутствие апо А-I не наблюдалось.Заключение. Полученный результат может свидетельствовать о доставке гена GFP в ядерный аппарат клетки, его экспрессии и синтезе белка GFP.
The aim of this study was to investigate the possibility of using apolipoprotein A-I (apo A-I) as a transport form of the green fluorescent protein (GFP) gene into rat hepatocytes.Material and methods. A culture of isolated rat hepatocytes was used as a model. Apo A-I conjugate with fluorescein isothiocyanate (FITC) was obtained by incubation of apo A-I protein with FITC in carbonate buffer pH 9.5 at a ratio of 12.5 μg FITC per 1 mg of protein. Plasmids for pE-GAG transfection with an integrated GFP gene were enriched in the promoter part with cis-elements of the CC(GCC)3-5 type to enhance complex formation with apo A-I. An inverted fluorescence microscope was used for visual analysis of cell fluorescence.Results and discussion. The paper presents evidence of FITC-labeled apo A-I penetration into the cytoplasm and nuclei of rat hepatocytes by receptor-mediated endocytosis. On this basis, it is proposed an attempt to use apo A-I as a means of targeted delivery of plasmid DNA with an integrated GFP gene into the cell. According to the results of fluorescence microscopy, the use of apo A-I as a plasmid DNA transfection agent led to the accumulation of the GFP protein in the cytoplasm of hepatocytes. No fluorescent protein was observed in the absence of apo A-I.Conclusions. The result obtained may indicate the delivery of the GFP gene to the nuclear apparatus of the cell, its expression and GFP protein synthesis.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.