ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ВАРИАНТОВ РЕКОМБИНАНТНОГО АПОЛИПОПРОТЕИНА А-I В КАЧЕСТВЕ ТРАНСПОРТЕРОВ МАЛЫХ ИНТЕРФЕРИРУЮЩИХ РНК В ОПУХОЛЕВЫЕ КЛЕТКИ

В связи с широким развитием явления РНК-интерференции перед исследователями стоит задача получения эффективных переносчиков малых интерферирующих РНК (миРНК). Ранее нами получен модифицированный рекомбинантный полипептид на основе аполипопротеина А-I человека (апо А-I), способный связываться с плазмидными ДНК. Цель исследования - изучение способности модифицированных рекомбинантных белков апо А-I переносить миРНК в опухолевые клетки. Материал и методы. Исследования проводились на модели трансформированных макрофагов мышей линии RAW 264.7, стабильно экспрессирующих ген зеленого флуоресцирующего белка GFP (клеточная линия клона 8А3). В качестве переносчиков миРНК использовали рекомбинантный про-апо А-I и модифицированный аналог про-апо А-I, несущий на С-конце 10 аминокислотных остатков лизина (апоАK10). Для трансфекции использовали липофектамин 2000 (lipofectamine 2000). Белки получали из соответствующих штаммов-продуцентов E. coli . Объектом переноса служил дуплекс миРНК, в котором один нуклеотид был комплементарен матричной РНК гена gfp . Измерение флуоресценции клеток проводили с помощью флуоресцентного планшетного анализатора. Результаты и их обсуждение. Обнаружено, что белки про-апо А и апо АK10, меченные флуоресцеина изотиоцианатом, проникают в клетки линии RAW 264.7. Результаты исследования РНК-интерференции показали, что инкубация клеток с миРНК и липофектамином 2000 вызывает снижение флуоресценции клеток линии 8А3, что свидетельствует о корректном подборе миРНК к матричной РНК гена gfp . В то же время флуоресценция клеток клона 8А3 при культивировании с миРНК и рекомбинантными формами про-апо А-I и апо АK10 не отличалась от флуоресценции контрольных клеток, инкубированных только с миРНК. Заключение. Рекомбинантные модифицированные формы про-апо А-I и апо АK10 проникают в трансформированные мышиные макрофаги линии RAW264.7, однако не способствуют явлению РНК-интерференции в этих клетках.

аполипопротеин А-I, рекомбинантные формы про-апо А-I и апо АK10, РНК-интерференция, миРНК, макрофаги линии RAW264.7

1. Котова М.В., Рябченко А.В., Трифонова Н.В., Князев Р.А., Поляков Л.М. Получение модифицированного рекомбинантного аполипопротеина А-I для переноса нуклеиновых кислот // Междунар. журн. прикл. и фундам. исслед. 2017. (12-2). 317-321.

2. Розенкранц А.А., Уласов А.В., Сластникова Т.А., Храмцов Ю.В., Соболев А.С. Использование процессов внутриклеточного транспорта для доставки лекарств в заданный компартмент клетки // Биохимия. 2014. 79. (9). 1148-1168.

3. Рябченко А.В., Котова М.В., Трифонова Н.В., Князев Р.А., Поляков Л.М. Изучение рекомбинантного аполипопротеина А-I как переносчика плазмидных ДНК на модели гепатоцитов крыс // Сиб. науч. мед. журн. 2017. 37. (6). 10-15.

4. Рябченко А.В., Котова М.В., Трифонова Н.В., Князев Р.А., Поляков Л.М. Изучение аполипопротеина А-I как переносчика малых интерферирующих РНК // Междунар. журн. прикл. и фундам. исслед. 2017. (12-1). 123-127.

5. Canine B.F., Hatefi A. Development of recombinant cationic polymers for gene therapy research // Adv. Drug Deliv. Rev. 2010. 62. (15). 1524-1529.

6. Canine B.F., Wang Y., Ouyang W., Hatefi A. Development of targeted recombinant polymers that can deliver siRNA to the cytoplasm and plasmid DNA to the cell nucleus // J. Control. Release. 2011. 151. (1). 95-101.

7. Danielle L.M., Kasey C.V. Lipoprotein carriers of microRNAs // Biochim. Biophys. Acta. 2016. 1861. (12). 2069-2074.

8. Farve G., Tazi K., Le G., Bennis F., Hachem H., Soula G. High density lipoprotein3 bindings sites are related to DNA biosynthesis in the adenocarcinoma cell line A549 // J. Lipid. Res. 1993. 34. (7). 1093-1106.

9. Kim S.I., Shin D., Lee H., Ahn B.Y., Yoon Y., Kim M. Targeted delivery of siRNA against hepatitis C virus by apolipoprotein A-I bound cationic liposomes // J. Hepatol. 2009. 50. (3). 479-488. Kratzer I., Werning K., Panzenboeck U., Bernhart E., Reicher H., Wronski R., Windisch M., Hammer A., Malle E., Zimmer A., Sattler W. Apolipoprotein A-I coating of protamine-oligonucleotide nanoparticles increases particle uptake and transcytosis in an in vitro model of the blood-brain barrier // J. Control. Release. 2007. 117. (3). 301-311.

10. Lee H., Kim S.I., Shin D., Yoon Y., Choi T.H., Cheon G.J., Kim M. Hepatic siRNA delivery using recombinant human apolipoprotein A-I in mice // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2009. 378. (2). 192-196.

11. Tabet F., Vickers K.C., Cuesta Torres L.F., Wiese C.B., Shoucri B.M., Lambert G., Catherinet C., Prado-Lourenco L., Levin M.G., Thacker S., Sethupathy P., Barter P.J, Remaley A.T., Rye K.A. HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells // Nat. Commun. 2014. 5. 3292.

12. Tschuch C., Schulz A., Pscherer A., Werft W., Benner A., Hotz-Wagenblatt A., Barrionuevo L.S., Lichter P., Mertens D. Off-target effects of siRNA specific for GFP // BMC Mol. Biol. 2008. 9. 60.