Использование аполипопротеина А-I в качестве компонента бессывороточной питательной среды для культивирования клеток костного мозга

Важным этапом в производстве препаратов для клеточной терапии и тканевой инженерии является культивирование клеток in vitro. Цель данной работы – исследовать влияние человеческого аполипопротеина А-I (апо A-I) на функциональную активность культивируемых клеток костного мозга и показать возможность использования данного белка в качестве компонента бессывороточной питательной среды. Материал и методы. Клетки костного мозга культивировали в 24-луночных планшетах в среде RPMI-1640 в СО2-инкубаторе при температуре 37 °С. В качестве интегрального показателя жизнеспособности клеток в процессе культивирования определяли уровень биосинтеза белка и ДНК по скорости включения [14С]-лейцина и [3Н]-тимидина в общий белок и ДНК соответственно. Результаты и их обсуждение. Установлено, что скорость биосинтеза ДНК в присутствии апо A-I была выше, чем в его отсутствие, на 55 % через 8 ч, на 523 % через 24 ч и на 219 % через 48 ч. В этих условиях также возрастала скорость биосинтеза общего белка. Полученные результаты свидетельствуют о том, что наличие апо A-I в бессывороточной питательной среде сохраняет функциональную активность культивируемых клеток костного мозга. Учитывая, что регуляторный эффект апо A-I достигается при небольшой концентрации белка (15 мкг/мл), использование апо A-I, выделенного из сыворотки крови пациента, позволит получить практически безопасную питательную среду для культивирования аутологичных клеток костного мозга в целях персонифицированной клеточной терапии и тканевой инженерии.

1. Нечаева Е.А., Радаева И.Ф., Думченко Н.Б., Сумкина Т.П., Богрянцева М.П., Сенькина Т.Ю. Бессывороточная питательная среда для культивирования клеток и вирусов. Вестн. ПНИПУ. Хим. технол. и биотехнол. 2018; (4): 85–97. doi: 10.15593/2224-9400/2018.4.07

2. Ткачук В.А., Акопян Ж.А., Калинина Н.И., Кочегура Т.Н., Тарасова Е.В., Ефименко А.Ю., Григорьева О.А., Сысоева В.Ю., Чапленко А.А., Сагарадзе Г.Д. Способ получения средства для стимуляции регенерации на основе продуктов секреции мультипотентных мезенхимных стромальных клеток человека. Пат. РФ 2620167; Опубл. 23.05.2017.

3. Трухан И.С. Питательная среда как ключевой фактор культивирования клеток млекопитающих. Междунар. журн. прикл. и фундам. исследований. 2018; 12 (1): 165–172. doi: 10.17513/mjpfi.12541

4. Усынин И.Ф., Панин Л.Е. Механизмы формирования фенотипической гетерогенности гепатоцитов. Биохимия. 2008; 73 (4): 453–468.

5. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. Томск, 1992. 264 с.

6. Mills G.L., Lane P.A., Weech P.K. A guidebook to lipoprotein technique. In: Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology. Vol. 14. Eds. R.H. Burdon, R.H. Knippenberg P.H. Amsterdam: Elsevier, 1984. 18–116.

7. Cham B.E., Knowlee B.R. A solvent system for delipidation of plasma or serum without protein preci­pitation. J. Lipid Res. 1976; (17): 176–181.

8. Jiang L., Hea L., Fountoulakis М. Comparison of protein precipitation methods for sample preparation prior to proteomic analysis. J. Chromatogr. A. 2004; 1023 (2): 317–320. doi: 10.1016/j.chroma.2003.10.029

9. Slot J.W., Geuze H.J. A new method of preparing gold probes for multiple-labeling cytochemistry. Eur. J. Cell Biol. 1985; 38 (1): 87–93.

10. Dawson C.W., Young L.S. In vitro assays to study epithelial cell growth. Methods Mol. Biol. 2001; 174: 165–172. doi: 10.1385/1-59259-227-9:165

11. Forte T.M., Bell-Quint J.J., Cheng F. Lipoproteins of fetal and newborn calves and adult steer: a study of developmental changes. Lipids. 1981; 16 (4): 240–245. doi: 10.1007/BF02535023

12. Astori G., Amati E., Bambi F., Bernardi M., Chieregato K., Schäfer K., Sella S., Rodeghiero F. Platelet lysate as a substitute for animal serum for the ex-vivo expansion of mesenchymal stem/stromal cells: present and future. Stem Cell Res. Ther. 2016; 7 (1): 93. doi: 10.1186/s13287-016-0352-x.2

13. Сергеева Н.С., Шанский Я.Д., Свиридова И.К., Кирсанова В.А., Ахмедова С.А., Кувшинова Е.А., Мейснер И.С. Биологические эффекты тромбоцитарного лизата при добавлении в среду культивирования клеток человека. Гены и клетки. 2014; (1): 77–85.

14. Brown R.L. Serum-free medium supporting growth and proliferation of normal bone marrow cells. US Patent № 5766951; Published 16.06.1998.

15. Быковская С.Н., Лысюк Е.Ю. Способ увеличения количества гемопоэтических недифференцированных стволовых клеток пациента ex vivo. Пат. РФ 2360965; Опубл. 10.07.2009.

16. Clark E. Refolding of recombinant proteins. Curr. Opin. Biotechnol. 1998; 9 (2): 157–163. doi: 10.1016/S0958-1669(98)80109-