Получение и анализ биологических свойств химерной формы рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека

Цель исследования - получение и изучение биологических свойств рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека (G-CSF), «сшитого» посредством пептидного линкера с аполипопротеином А-I (apoA-I), для разработки в перспективе на его основе цитокина пролонгированного действия.

Материал и методы. Нуклеотидные последовательности генов G-CSF и apoA-I были оптимизированы для экспрессии в дрожжах Pichiapastoris. Сборку гена, кодирующего химерный цитокин G­CSF­аpoA­I, его клонирование в составе вектора pPICZa-A и экспрессию в клетках Ppastoris выполняли с использованием стандартных генноинженерных методов. Полученный цитокин очищали методом двухступенчатой ионообменной хроматографии. Биологическую активность химеры определяли invitro на клетках костного мозга (ККМ) крысы и человека с применением методов проточной цитометрии, анализа клеточного цикла и миелограмм.

Результаты. Сконструирован рекомбинантный штамм дрожжей Ppastoris Х-33, продуцирующий химерный цитокин, содержащий с N-конца аминокислотную последовательность G-CSF, а с С-конца - зрелого apoA-I человека. На ККМ крыс показано, что G-G­CSF­аpoA­I в 1,8-2 раза менее эффективно увеличивает количество гранулоцитов, чем G-CSF. Вместе с тем химерный цитокин поддерживал жизнеспособность клеток моноцитарного и лимфоцитарного ряда и так же, как G-CSF, поддерживал пролиферацию и созревание клеток гранулоцитарного ряда. В отличие от G-CSF, химера повышала количество бластных клеток и нормализовала сегментацию нейтрофилов, в 1,5 раза эффективнее снижая количество аномалий.

Заключение. Сконструирован новый химерный цитокин G-CSF-ароА-I, проявляющий свойства не только колониестимулирующего, но и ростового фактора, поддерживающего жизнеспособность других типов ККМ.

1. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. Томск: Изд-во Том. ун-та, 1992. 272 с.

2. Acton S., Rigotti A., Landschulz K.T., Xu S., Hobbs H.H., Krieger M. Identification of scavenger receptor SR-BI as a high density lipoprotein receptor. Science. 1996; 271 (5248): 518-520. doi: 10.1126/science.271.5248.518

3. Bai Y., Ann D.K., Shen W.C. Recombinant granulocyte colony-stimulating factor-transferrin fusion protein as an oral myelopoietic agent. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005; 102 (20): 7292-7296. doi: 10.1073/pnas.0500062102

4. Cereghino J.L., Cregg J.M. Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pas-toris. FEMS Microbiol. Rev. 2000; 24 (1); 45-66. doi: 10.1111/j.1574-6976.2000.tb00532.x

5. Cox G.N., Smith D.J., Carlson S.J., Bende-le A.M., Chlipala E.A., Doherty D.H. Enhanced circulating half-life and hematopoietic properties of a human granulocyte colony-stimulating factor/immunoglobulin fusion protein. Exp. Hematol. 2004: 32 (5); 441-449. doi: 10.1016/j.exphem.2004.01.012

6. Fioravanti J., Gonzalez I., Medina-Echeverz J., Larrea E., Ardaiz N., Gonzalez Aseguinolaza G., Prieto J., Berraondo P. Anchoring interferon alpha to apoli-poprotein A-I reduces hematological toxicity while enhancing immunostimulatory properties. Hepatology. 2011; 53 (6): 1864-1873. doi: 10.1002/hep.24306

7. Garay R.P., El-Gewely R., Armstrong J.K., Gar-ratty G., Richette P. Antibodies against polyethylene glycol in healthy subjects and in patients treated with PEG-conjugated agents. Expert Opin. Drug Deliv. 2012; 9 (11): 1319-1323. doi: 10.1517/17425247.2012.720969

8. Halpern W., Riccobene T.A., Agostini H., Baker K., Stolow D., Gu M.L., Hirsch J., Mahoney A., Carrell J., Boyd E., Grzegorzewski K.J. Albugranin, a recombinant human granulocyte colony stimulating factor (GCSF) genetically fused to recombinant human albumin induces prolonged myelopoietic effects in mice and monkeys. Pharm. Res. 2002; 19 (11): 1720-1729. doi: 10.1023/a:1020917732218

9. Kim S.I., Shin D., Choi T.H., Lee J.C., Cheon G.J., Kim K.Y., Park M., Kim M. Systemic and specific delivery of small interfering RNAs to the liver mediated by apolipoprotein A-I. Mol. Ther. 2007; 15 (6): 1145-1152. doi: 10.1038/sj.mt.6300168

10. Kuai R., Li D., Chen Y.E., Moon J.J., Schwen-deman A. High-density lipoproteins: Nature’s multifunctional nanoparticles. ACS Nano. 2016; 10 (3): 3015-3041. doi: 10.1021/acsnano.5b07522

11. Kuwabara T., Kobayashi S., Sugiyama Y. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of a recombinant human granulocyte colony-stimulating factor. Drug Metab. Rev. 1996; 28 (4): 625-658. doi: 10.3109/03602539608994020

12. Lu C.Z., Xiao B.G. G-CSF and neuroprotection: a therapeutic perspective in cerebral ischaemia. Biochem. Soc. Trans. 2006; 34 (6): 1327-1333. doi: 10.1042/BST0341327

13. Meuer K., Pitzer C., Teismann P., Kruger C., Goricke B., Laage R., Lingor P., Peters K., Schlachet-zki J.C., Kobayashi K., Dietz G.P., Weber D., Ferger B., Schabitz W.R., Bach A., Schulz J.B., Bahr M., Schneider A., Weishaupt J.H. Granulocyte-colony stimulating factor is neuroprotective in a model of Parkinson’s disease. J. Neurochem. 2006; 97 (3): 675-686. doi: 10.1111/j.1471-4159.2006.03727.x

14. Prakash A., Medhi B., Chopra K. Granulocyte colony stimulating factor (GCSF) improves memory and neurobehavior in an amyloid-P induced experimental model of Alzheimer’s disease. Pharmacol. Biochem. Behav. 2013; 110: 46-57. doi: 10.1016/j.pbb.2013.05.015

15. Puchkov I.A., Kononova N.V., Bobruskin A.I., Bairamashvili D.I., Mart’ianov V.A., Shuster A.M. Recombinant granulocyte-colony stimulating factor (filgrastim): optimization of conjugation with polyethylene glycol. Bioorg. Chem. 2012; 38 (5): 545-554. doi: 10.1134/s1068162012050111

16. Viret F., Gon?alves A., Tarpin C., Chaban-non C., Viens P. G-CSF en oncologie. Bull. Cancer. 2006; 93 (5): 463-471. Viret F., Gon?alves A., Tarpin C., Chabannon C., Viens P. G-CSF in oncology. Bull. Cancer. 2006; 93 (5): 463-471. [In French].