ХАРАКТЕРИСТИКА КУЛЬТУР КЛЕТОК, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ ЛИМБА ЧЕЛОВЕКА

В лимбе локализованы лимбальные эпителиальные стволовые клетки, которые обеспечивают регенерацию эпителия роговицы, как физиологическую, так и репаративную. Целью данной работы являлась характеристика клеточных культур, полученных из лимбального графта человека различными методами.

Материал и методы. Лимбальные стволовые клетки получали из области лимба энуклеированных глаз человека ферментативным методом и методом экспланта. Культивирование клеток осуществляли на амниотической мембране и без нее, в ростовых средах DMEM/F12 (Dullbecco’s Modified Eagle Medium/Nutrient F12 Ham) и CECBM (Corneal Epithelial Cell Basal Medium). Проведена морфологическая оценка и иммунофенотипирование клеточных культур.

Результаты и их обсуждение. При ферментативном методе выделения полученная культура клеток отличалась гетерогенностью, в суспензии неадгезированных клеток выявлено присутствие фибробластоподобных клеток, которые по внешнему виду и характеру роста напоминали стромальные. При иммунофенотипировании выявлено, что большинство клеток несут маркеры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (CD90+/CD73+/CD105+/CD34–/CD45–) и меньшее количество – маркеры эпителиальных клеток (p63α+, ABCG2 +, CK19+). Культура, полученная методом экспланта, была более однородной. Клетки имели округлую эпителиоцитоподобную форму, хорошо адгезировались к поверхности амниотической мембраны и росли на ней. Результаты фенотипирования свидетельствуют, что они представлены главным образом эпителиальными клетками (p63α+, ABCG2 +, CK19+).

Заключение. При ферментативном методе выделения клеток из лимбального графта и культивировании их без фидера в ростовой среде DMEM/F12 культура представлена главным образом мультипотентными мезенхимальными стволовыми клетками. Выделение клеток лимба методом экспланта и культивирование их в селективной среде CECBM позволяют получить преимущественно культуру эпителиальных стволовых клеток.

1. Branch M.J., Hashmani K., Dhillon P., Jones D.R., Dua H.S., Hopkinson A. Mesenchymal stem cells in the human corneal limbal stroma // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2012. 53. 5109–5116.

2. Chen Z., de Paiva C.S., Luo L., Kretzer F.L., Pflugfelder S.C., Li D.-Q. Characterization of putative stem cell phenotype in human limbal epithelia // Stem Cells. 2004. 22. (3). 355–366.

3. Dhamodaran K., Subramani M., Jeyabalan N., Ponnalagu M., Chevour P., Shetty R., Matalia H., Shetty R., Prince S.E., Das D. Characterization of ex vivo cultured limbal, conjunctival, and oral mucosal cells: A comparative study with implications in transplantation medicine // Mol. Vis. 2015. 21. 828–845.

4. Dominici M., Blanc K.L., Mueller I., SlaperCortenbach I., Marini F.C., Krause D.S., Deans R.J., Keating A., Prockop D.J., Horwitz E.M. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement // Cytotherapy. 2006. 8. (4). 315–317.

5. Dua H.S., Azuara-Blanco A. Limbal stem cells of the corneal epithelium // Surv. Ophthalmol. 2000. 44. 415–425.

6. Funderburgh J.L., Funderburgh M.L., Yiqin Du Y. Stem cells in the limbal stroma // Ocul. Surf. 2016. 14. (2). 113–120.

7. Ghoubay-Benallaoua D., de Sousa C., Martos R., Latour G., Schanne-Klein C., Dupin E., Borderie V. Easy xeno-free and feeder free method for isolation and growing limbal stromal and epithelial stem cells of the human cornea // Plоs One. 2017. 17. 1–18.

8. Gonzalez G., Sasamoto Y., Ksander B.R., Frank M.H., Frank N.Y. Limbal stem cells: identity, developmental origin, and therapeutic potential // Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 2017. 7. (2). e303.

9. Haagdorens M., van Acker S.I., van Gerwen V., Ní Dhubhghaill S., Koppen C., Tassignon M.-J., Zakaria N. Limbal stem cell deficiency: Current treatment options and emerging therapies // Stem Cells Int. 2016. 2016. ID 9798374.

10. Hashmani K., Branch M.J., Sidney L.E., Dhillon P.S., Verma M., Mclntoch O.D., Horkinson A., Dua H.S. Characterization of corneal stromal stem cells with the potencial for epithelial transdifferentiation // Stem Cell Res. Ther. 2013. 4. (75). 1–13.

11. Li G.-G., Zhu Y.-T., Xie H.-T., Chen S.-Y., Tseng S.C.G. Mesenchymal stem cells derived from human limbal niche cells // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2012. 53. 5686–5697.

12. Luznik Z., Hawlina M., Malicev E., Bertolin M., Kopitar A.N., Ihan A., Ferrari S., Schollmayer P. Effect of cryopreserved amniotic membrane orientation on the expression of limbal mesenchymal and epithelial stem cell markers in prolonged limbal explant cultures // Plos One. 2016. 11. (10). 1–17.

13. Polisetty N., Fatima A., Madhira S.L., Sangwan V.S., Vemuganti G.K. Mesenchymal cells from limbal stroma of human eye // Mol. Vis. 2008. 14. 431–442.

14. Sacchetti M., Rama P., Bruscolini A., Lambiase A. Limbal stem cell transplantation: Clinical results, limits, and perspectives // Stem Cells Int. 2018. 2018. ID 8086269.

15. Xie H.-T., Chen S.-Y., Li G.-G., Tseng S.C.G. Isolation and expansion of human limbal stromal niche cells // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2012. 53. 279–286.