sibmedСибирский научный медицинский журналСибирский научный медицинский журнал2410-25122410-2520ИЦиГ СО РАН10.15372/SSMJ20200403sibmed-448Research ArticleМЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИBIOMEDICINEИспользование аполипопротеина А-I в качестве компонента бессывороточной питательной среды для культивирования клеток костного мозгаThe use of apolipoprotein A-I as a component of serum-free nutrient medium for bone marrow cell culturehttps://orcid.org/0000-0002-5339-3851ГородецкаяА. Ю.GorodetskayaA. Yu.

Анна Юрьевна Городецкая

Anna Yu. Gorodetskaya

a.pe4enkina@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0002-3783-4418ТкаченкоТ. А.TkachenkoT. A.

Татьяна Александровна Ткаченко

Tatyana A. Tkachenko

vadanyata@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0003-1639-6196ДударевА. Н.DudarevA. N.

Алексей Николаевич Дударев

Alexey N. Dudarev, candidate of biological sciences

alexdud@ngs.ruhttps://orcid.org/0000-0002-7384-9115ЧешенкоИ. О.CheshenkoI. O.

Игорь Олегович Чешенко

Igor O. Cheshenko

cheshenko@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0003-1752-9034УсынинИ. Ф.UsyninI. F.

Иван Федорович Усынин, д.б.н.

Ivan F. Usynin, doctor of biological sciences

ivan.usynin@niibch.ruНИИ биохимии ФИЦ фундаментальной и трансляционной медициныРоссияInstitute of Biochemistry of Federal Research Center for Fundamental and Translational MedicineRussian Federation2020270820204042027Copyright © Городецкая А.Ю., Ткаченко Т.А., Дударев А.Н., Чешенко И.О., Усынин И.Ф., 20202020Городецкая А.Ю., Ткаченко Т.А., Дударев А.Н., Чешенко И.О., Усынин И.Ф.Gorodetskaya A.Y., Tkachenko T.A., Dudarev A.N., Cheshenko I.O., Usynin I.F.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://sibmed.elpub.ru/jour/article/view/448

Важным этапом в производстве препаратов для клеточной терапии и тканевой инженерии является культивирование клеток in vitro. Цель данной работы – исследовать влияние человеческого аполипопротеина А-I (апо A-I) на функциональную активность культивируемых клеток костного мозга и показать возможность использования данного белка в качестве компонента бессывороточной питательной среды. Материал и методы. Клетки костного мозга культивировали в 24-луночных планшетах в среде RPMI-1640 в СО2-инкубаторе при температуре 37 °С. В качестве интегрального показателя жизнеспособности клеток в процессе культивирования определяли уровень биосинтеза белка и ДНК по скорости включения [14С]-лейцина и [3Н]-тимидина в общий белок и ДНК соответственно. Результаты и их обсуждение. Установлено, что скорость биосинтеза ДНК в присутствии апо A-I была выше, чем в его отсутствие, на 55 % через 8 ч, на 523 % через 24 ч и на 219 % через 48 ч. В этих условиях также возрастала скорость биосинтеза общего белка. Полученные результаты свидетельствуют о том, что наличие апо A-I в бессывороточной питательной среде сохраняет функциональную активность культивируемых клеток костного мозга. Учитывая, что регуляторный эффект апо A-I достигается при небольшой концентрации белка (15 мкг/мл), использование апо A-I, выделенного из сыворотки крови пациента, позволит получить практически безопасную питательную среду для культивирования аутологичных клеток костного мозга в целях персонифицированной клеточной терапии и тканевой инженерии.

An important step in preparation of cells for cell therapy and tissue engineering is the cultivation of cells in vitro. The aim of this work is to study the effect of human apolipoprotein A-I (apoA-I) on the functional activity of cultured bone marrow cells and to show the possibility of using this protein instead of animal fetal serum. Material and methods. Bone marrow cells were cultured in 24-well plates in RPMI-1640 medium in a CO2 incubator at a temperature of 37 °C. The rate of incorporation of [14C]-leucine into the total cell protein and [3H]-thymidine into the DNA was used as an integral indicator of cell viability during cultivation. Results and discussion. It was found that the rate of DNA synthesis in bone marrow cells in the presence of apo A-I increased compared with the control group (without apo A-I) by 55 % after 8 hours, by 523 % after 24 hours and by 219 % after 48 hours. Under these conditions the rate of protein synthesis was also increased. The results indicate that the presence of apo A-I in serum-free culture medium preserves the functional activity of cultured bone marrow cells. Considering that the regulatory effect of apo A-I is achieved at a low protein concentration in the medium (15 μg/ml), isolation of apo A-I from the patient’s own blood serum will provide a practically safe nutrient medium for culturing autologous bone marrow cells with applications in personalized cell therapy and tissue engineering.

аполипопротеин А-Iкультура клетокклетки костного мозгабессывороточная питательная средабиосинтез ДНКapolipoprotein A-Icell culturebone marrow cellsserum-free culture mediumDNA synthesisReferencesНечаева Е.А., Радаева И.Ф., Думченко Н.Б., Сумкина Т.П., Богрянцева М.П., Сенькина Т.Ю. Бессывороточная питательная среда для культивирования клеток и вирусов. Вестн. ПНИПУ. Хим. технол. и биотехнол. 2018; (4): 85–97. doi: 10.15593/2224-9400/2018.4.07Nechaeva E.A., Radaeva I.F., Dumchenko N.B., Sumkina T.P., Bogryantseva M.P., Senkina T.Yu. Serum free medium for cultivation of cells and viruses. Vestnik Permskogo natsional’nogo issledovatel’skogo politekhnicheskogo universiteta. Khinicheskaya tekhnologiya i biotekhnologiya = Bulletin of Perm National Research Polytechnic University. Chemical technology and biotechnology. 2018; (4): 85–97. [In Russian]. doi: 10.15593/2224-9400/2018.4.07Ткачук В.А., Акопян Ж.А., Калинина Н.И., Кочегура Т.Н., Тарасова Е.В., Ефименко А.Ю., Григорьева О.А., Сысоева В.Ю., Чапленко А.А., Сагарадзе Г.Д. Способ получения средства для стимуляции регенерации на основе продуктов секреции мультипотентных мезенхимных стромальных клеток человека. Пат. РФ 2620167; Опубл. 23.05.2017.Tkachuk V.A., Akopyan Zh.A., Kalinina N.I., Kochegura T.N., Tarasova E.V., Efimenko A.Yu., Grigoryeva O.A., Sysoeva V.Yu., Chaplenko A.A., Sagaradze G.D. A method of obtaining a means for stimulating regeneration based on the secretion products of multipotent mesenchymal stromal cells of a person. Patent RF 2620167; Published 23.05.2017. [In Russian].Трухан И.С. Питательная среда как ключевой фактор культивирования клеток млекопитающих. Междунар. журн. прикл. и фундам. исследований. 2018; 12 (1): 165–172. doi: 10.17513/mjpfi.12541Trukhan I.S. Culture medium as a key factor in the cultivation of mammalian cells. Mezhdunarodnyy zhurnal prikladnykh i fundamental’nykh issledovaniy = International Journal of Applied and Basic Research. 2018; 12 (1): 165–172. [In Russian]. doi: 10.17513/mjpfi.12541Усынин И.Ф., Панин Л.Е. Механизмы формирования фенотипической гетерогенности гепатоцитов. Биохимия. 2008; 73 (4): 453–468.Usynin I.F., Panin L.E. Mechanisms determining phenotypic heterogeneity of hepatocytes. Biokhimiya = Biochemistry (Mosc.). 2008; 73 (4): 367–380. doi: 10.1134/s0006297908040019Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. Томск, 1992. 264 с.Goldberg E.D., Dygay A.M., Shakhov V.P. Methods of tissue culture in hematology. Tomsk, 1992. 264 p. [In Russian].Mills G.L., Lane P.A., Weech P.K. A guidebook to lipoprotein technique. In: Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology. Vol. 14. Eds. R.H. Burdon, R.H. Knippenberg P.H. Amsterdam: Elsevier, 1984. 18–116.Mills G.L., Lane P.A., Weech P.K. A guidebook to lipoprotein technique. In: Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology. Vol. 14. Eds. R.H. Burdon, R.H. Knippenberg P.H. Amsterdam: Elsevier, 1984. 18–116.Cham B.E., Knowlee B.R. A solvent system for delipidation of plasma or serum without protein preci­pitation. J. Lipid Res. 1976; (17): 176–181.Cham B.E., Knowlee B.R. A solvent system for delipidation of plasma or serum without protein preci­pitation. J. Lipid Res. 1976; (17): 176–181.Jiang L., Hea L., Fountoulakis М. Comparison of protein precipitation methods for sample preparation prior to proteomic analysis. J. Chromatogr. A. 2004; 1023 (2): 317–320. doi: 10.1016/j.chroma.2003.10.029Jiang L., Hea L., Fountoulakis М. Comparison of protein precipitation methods for sample preparation prior to proteomic analysis. J. Chromatogr. A. 2004; 1023 (2): 317–320. doi: 10.1016/j.chroma.2003.10.029Slot J.W., Geuze H.J. A new method of preparing gold probes for multiple-labeling cytochemistry. Eur. J. Cell Biol. 1985; 38 (1): 87–93.Slot J.W., Geuze H.J. A new method of preparing gold probes for multiple-labeling cytochemistry. Eur. J. Cell Biol. 1985; 38 (1): 87–93.Dawson C.W., Young L.S. In vitro assays to study epithelial cell growth. Methods Mol. Biol. 2001; 174: 165–172. doi: 10.1385/1-59259-227-9:165Dawson C.W., Young L.S. In vitro assays to study epithelial cell growth. Methods Mol. Biol. 2001; 174: 165–172. doi: 10.1385/1-59259-227-9:165Forte T.M., Bell-Quint J.J., Cheng F. Lipoproteins of fetal and newborn calves and adult steer: a study of developmental changes. Lipids. 1981; 16 (4): 240–245. doi: 10.1007/BF02535023Forte T.M., Bell-Quint J.J., Cheng F. Lipoproteins of fetal and newborn calves and adult steer: a study of developmental changes. Lipids. 1981; 16 (4): 240–245. doi: 10.1007/BF02535023Astori G., Amati E., Bambi F., Bernardi M., Chieregato K., Schäfer K., Sella S., Rodeghiero F. Platelet lysate as a substitute for animal serum for the ex-vivo expansion of mesenchymal stem/stromal cells: present and future. Stem Cell Res. Ther. 2016; 7 (1): 93. doi: 10.1186/s13287-016-0352-x.2Astori G., Amati E., Bambi F., Bernardi M., Chieregato K., Schäfer K., Sella S., Rodeghiero F. Platelet lysate as a substitute for animal serum for the ex-vivo expansion of mesenchymal stem/stromal cells: present and future. Stem Cell Res. Ther. 2016; 7 (1): 93. doi: 10.1186/s13287-016-0352-x.2Сергеева Н.С., Шанский Я.Д., Свиридова И.К., Кирсанова В.А., Ахмедова С.А., Кувшинова Е.А., Мейснер И.С. Биологические эффекты тромбоцитарного лизата при добавлении в среду культивирования клеток человека. Гены и клетки. 2014; (1): 77–85.Sergeeva N.S., Shansky Ya.D., Sviridova I.K., Kir­sanova V.A., Akhmedova S.A., Kuvshinova E.A., Meisner I.S. Biological effects of platelet lysate when added to human cell culture medium. Geny i kletki = Genes and Cells. 2014; (1): 77–85. [In Russian].Brown R.L. Serum-free medium supporting growth and proliferation of normal bone marrow cells. US Patent № 5766951; Published 16.06.1998.Brown R.L. Serum-free medium supporting growth and proliferation of normal bone marrow cells. US Patent № 5766951; Published 16.06.1998.Быковская С.Н., Лысюк Е.Ю. Способ увеличения количества гемопоэтических недифференцированных стволовых клеток пациента ex vivo. Пат. РФ 2360965; Опубл. 10.07.2009.Bykovskaya S.N., Lysyuk E.Yu. The method of increasing the number of hematopoietic undifferentiated stem cells of a patient ex vivo. Patent RF 2360965; Published 10.07.2009. [In Russian].Clark E. Refolding of recombinant proteins. Curr. Opin. Biotechnol. 1998; 9 (2): 157–163. doi: 10.1016/S0958-1669(98)80109-Clark E. Refolding of recombinant proteins. Curr. Opin. Biotechnol. 1998; 9 (2): 157–163. doi: 10.1016/S0958-1669(98)80109-

The authors declare that there are no conflicts of interest present.