sibmedСибирский научный медицинский журналСибирский научный медицинский журнал2410-25122410-2520ИЦиГ СО РАН10.15372/SSMJ20190516sibmed-285Research ArticleКЛИНИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНАCLINICAL MEDICINEВНУТРИОПУХОЛЕВАЯ ГЕТЕРОГЕННОСТЬ АМПЛИФИКАЦИИ В HER2/neu-ПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПОДТИПАХ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫINTRATUMORAL AMPLIFICATION HETEROGENEITY IN HER2/neu-POSITIVE BREAST CANCER MOLECULAR-GENETIC SUBTYPEShttps://orcid.org/0000-0003-2267-3460ВащенкоЛ. Н.VashchenkoL. N.

д.м.н., проф., 

344037, г. Ростов-на-Дону, ул. 14-я линия, 63

doctor of medical sciences, professor

344037, Rostov-on-Don, 14th Line, 63

rnioi@list.ruhttps://orcid.org/0000-0002-0677-7991ЗавалишинаЛ. Э.ZavalishinaL. E.

д.б.н., проф., ORCID: , e-mail:

125993, г. Москва, ул. Баррикадная, 2/1, стр. 1

doctor of biological sciences

125993, Moscow, Barrikadnaya, 2/1, bldg. 1

pat.rmapo@rmapo.ruhttps://orcid.org/0000-0002-4578-8263ПавленкоИ. А.PavlenkoI. A.

ropab@aaanet.ru

344015, г. Ростов-на-Дону, ул. Благодатная, 170а

344015, Rostov-on-Don, Blagodatnaya, 170a

pavlenko.ir@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-0934-0349ПовилайтитеП. Е.PovilaititeP. E.

к.б.н.,

344015, г. Ростов-на-Дону, ул. Благодатная, 170а

candidate of biological sciences

344015, Rostov-on-Don, Blagodatnaya, 170a

ropab@aaanet.ruРостовский научно-исследовательский онкологический институт Минздрава РоссииРоссияRostov Research Institute of Oncology of Minzdrav of RussiaRussian FederationРоссийская медицинская академия непрерывного профессионального образования Минздрава РоссииРоссияRussian Medical Academy of Continuous Professional Education of Minzdrav of RussiaRussian FederationПатолого-анатомическое бюроРоссияRostov Regional Bureau of PathologyRussian Federation201903112019395134140Copyright © Ващенко Л.Н., Завалишина Л.Э., Павленко И.А., Повилайтите П.Е., 20192019Ващенко Л.Н., Завалишина Л.Э., Павленко И.А., Повилайтите П.Е.Vashchenko L.N., Zavalishina L.E., Pavlenko I.A., Povilaitite P.E.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://sibmed.elpub.ru/jour/article/view/285

Люминальный В HER2/neu-положительный и HER2/neu-положительный (не люминальный) подтипы рака молочной железы (РМЖ) характеризуются амплификацией гена HER2/neu и гиперэкспрессией соответствующего белка на мембране опухолевых клеток. Для лечения пациентов c HER2/neu-положительным РМЖ разработаны и применяются в различном режиме и комбинациях несколько таргетных препаратов, однако их использование существенно ограничено первичной или приобретенной резистентностью, в основе которой лежит множество факторов, в том числе и генетическая гетерогенность опухоли. Целью нашей работы было оценить гетерогенность амплификации HER2/neu в HER2/neu-положительных подтипах РМЖ – люминальном В HER2/neu-положительном и HER2/neu-положительном (не люминальном). Материал и методы. В исследование вошли 210 пациентов с неопределенной (2+) иммуногистохимической оценкой экспрессии HER2/neu, которым в рамках первичной диагностики РМЖ выполняли FISH-исследование с двойной флуоресцентной меткой для оценки статуса гена HER2/neu. Результаты и их обсуждение. В ходе исследования было выявлено, что ген HER2/neu, экспрессия которого имеет основополагающее значение в патогенезе люминального В HER2/neu-положительного и HER2/neu-положительного (не люминального) РМЖ, характеризуется выраженным гетерогенным характером амплификации в 31 % случаев. При этом как гетерогенные мы интерпретировали опухоли, содержащие клетки с соотношением HER2/CEP17 < 2 и количеством копий гена 4 ≤ HER2/neu < 6, т.е. клетки с отсутствием амплификации гена HER2/neu. Группы люминальных В и HER2/neu-положительных опухолей статистически значимо не различались по количеству гетерогенных по амплификации HER2/neu. В ходе ROC-анализа была установлена диагностическая значимость показателя HER2/CEP17 для выявления гетерогенности опухоли: пороговое значение показателя, при котором достигалась диагностическая эффективность 95 %, составило 2,6. Заключение. Гетерогенность амплификации HER2/neu обнаруживается при FISH-анализе в 31 % случаев РМЖ и не зависит от принадлежности опухоли к люминальному В HER2/neu-положительному или HER2/neu-положительному (не люминальному) подтипу. Если в образце опухоли с положительным HER2/neu-статусом соотношение HER2/CEP17 ≤ 2,6, такой образец с вероятностью 95 % будет содержать минорные субклоны без амплификации HER2/neu. Феномен гетерогенности амплификации HER2/neu в HER2/neu-положительных опухолях может иметь важное значение при прогнозировании исхода заболевания и выбора тактики лечения РМЖ.

The defining feature of HER2/neu-positive Luminal B and HER2/neu-positive (non-luminal) subtype breast cancer is HER2/neu gene amplification and protein overexpression on cancer cell membrane. The HER2-targeted therapy is nowadays available for patients with HER2-positive breast cancer However, a significant fraction of HER2+ tumors acquire or possess intrinsic mechanisms of resistance, based on multiple factors, and genetic heterogeneity among them. The aim of our study was to quantify the heterogeneity of HER2/neu amplification in HER2/neu-positive Luminal B and HER2/neu-positive (non-luminal) subtypes of breast cancer. Material and methods. A retrospective analysis of 210 cases referred for dual probe fluorescence in situ hybridization (FISH) confirmation of an immunohistochemical equivocal 2+ result was performed. Results. Our results demonstrated a heterogeneous amplification pattern of HER2/neu gene, whose expression is a substantial cause of HER2/neu-positive Luminal B and HER2/neu-positive (non-luminal) subtypes of breast cancer, in 31 % of invasive breast cancer cases. As heterogeneous, we interpreted tumors containing cells with HER2/CEP17 ratio < 2 and gene copies 4 ≤ HER2/neu < 6, that is, those without HER2/neu amplification. The amount of heterogeneous tumors between HER2/neu-positive Luminal B and HER2/neu-positive (non-luminal) subtypes was not statistically significant. ROC analyses identified optimal cutoff point for HER2/CEP17 ratio as 2.6 for distinguishing heterogeneous tumors. Conclusion. The heterogeneity of HER2/neu amplification is determined by FISH in 31 % of cases and is independent of molecular breast cancer subtype. If a HER2/neu-positive breast cancer has HER2/CEP17 ratio ≤ 2,6, it contains minor subclones without HER2/neu amplification with a probability of 95 %. Our results demonstrated that HER2/neu amplification heterogeneity may be important for prognosis of survival and treatment decisions.

рак молочной железывнутриопухолевая гетерогенностьамплификация гена HER2флуоресцентная гибридизация in situтаргетная терапияbreast cancerintratumoral heterogeneityHER2 gene amplificationfluorescence in situ hybridization (FISH)targeted therapyReferencesЗавалишина Л.Э., Данилова Н.В., Мационис А.Э., Павленко И.А. Особенности амплификации генов на длинном плече 17-й хромосомы в различных молекулярно-генетических подтипах рака молочной железы. Арх. патологии. 2014; 76 (2): 8–12.Zavalishina L.E., Danilova N.V., Matsionis A.E., Pavlenko I.A. Specific features of gene amplification on the long arm of chromosome 17 in different molecular genetic subtypes of breast cancer. Arkhiv patologii = Archiv of Pathology. 2014; 76 (2): 8–12. [In Russian].Злокачественные новообразования в России в 2017 году (заболеваемость и смертность). Ред. А.Д. Каприн, В.В. Старинский, Г.В. Петрова. М.: МНИОИ им. П.А. Герцена филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, 2018. 250 с.Malignant tumours in Russia in 2017 (morbidity and mortality). Eds. A.D. Kaprin, V.V. Starinsky, G.V. Petrova. Moscow, 2018. 250 p. [In Russian].Колядина И.В., Поддубная И.В., Франк Г.А., Комов Д.В., Карселадзе А.И., Ермилова В.Д., Вишневская Я.В. Гетерогенность рака молочной железы I стадии: биологическое и прогностическое значение. Злокачеств. опухоли. 2015; 4 (1): 35–45. doi: 10.18027/2224-5057-2015-1-31-40.Kolyadina I.V., Poddubnaya I.V., Frank G.A., Komov D.V., Karseladze A.I., Ermilova V.D., Vishnevskaya Ya.V. Heterogenety of stage I breast cancer: biological and prognostic value. Zlokachestvennye opukholi = Malignant Tumours. 2015; 4 (1): 35–45. [In Russian]. doi: 10.18027/2224-5057-2015-1-31-40.Стенина М.Б. HER2 как мишень современной противоопухолевой терапии рака молочной железы. Эффектив. фармакотерапия. 2015; (10): 24–31.Stenina M.B. HER2 as a target for modern anti-tumor therapy of breast cancer. Effektivnaya farmakoterapiya = Effective Pharmacotherapy. 2015; (10): 24–31. [In Russian].Рак молочной железы. Практическое руководство для врачей. Ред. Г.А. Франк, Л.Э. Завалишина, К.М. Пожарисский. М.: РМАПО, 2014. 168 c.Breast cancer. Practical guide for doctors. Eds. G.A. Frank, L.E. Zavalishina, K.M. Pozharissky. Moscow, 2014. 168 p. [In Russian].Beca F., Polyak K. Intratumor heterogeneity in breast cancer. Adv. Exp. Med. Biol. 2016; 882: 169–189. doi: 10.1007/978-3-319-22909-6_7.Beca F., Polyak K. Intratumor heterogeneity in breast cancer. Adv. Exp. Med. Biol. 2016; 882: 169–189. doi: 10.1007/978-3-319-22909-6_7.Buckley N.E., Forde C., McArt D.G., Boyle D.P., Mullan P.B., James J.A., Maxwell P., McQuaid S., Salto-Tellez M. Quantification of HER2 heterogeneity in breast cancer-implications for identification of subdominant clones for personalised treatment. Sci. Rep. 2016; 6: 23383. doi: 10.1038/srep23383.Buckley N.E., Forde C., McArt D.G., Boyle D.P., Mullan P.B., James J.A., Maxwell P., McQuaid S., Salto-Tellez M. Quantification of HER2 heterogeneity in breast cancer-implications for identification of subdominant clones for personalised treatment. Sci. Rep. 2016; 6: 23383. doi: 10.1038/srep23383.Ellsworth R.E., Blackburn H.L., Shriver C.D., Soon-Shiong P., Ellsworth D.L. Molecular heterogeneity in breast cancer: State of the science and implications for patient care. Semin. Cell Dev. Biol. 2017; 64: 65–72. doi: 10.1016/j.semcdb. 2016.08.025.Ellsworth R.E., Blackburn H.L., Shriver C.D., Soon-Shiong P., Ellsworth D.L. Molecular heterogeneity in breast cancer: State of the science and implications for patient care. Semin. Cell Dev. Biol. 2017; 64: 65–72. doi: 10.1016/j.semcdb. 2016.08.025.Krishnamurti U., Silverman J.F. HER2 in breast cancer: a review and update. Adv. Anat. Pathol. 2014; 21 (2): 100–107. doi: 10.1097/PAP.0000000000000015.Krishnamurti U., Silverman J.F. HER2 in breast cancer: a review and update. Adv. Anat. Pathol. 2014; 21 (2): 100–107. doi: 10.1097/PAP.0000000000000015.Landmann A., Farrugia D.J., Diego E., Bonaventura M., Soran A., Johnson R., Dabbs D.J., Clark B., Brufsky A., Davidson N.E., Lembersky B.C., Jankowitz R.C., Puhalla S., Ahrendt G.M., McAuliffe P.F., Bhargava R. HER2 equivocal breast cancer and neoadjuvant therapy: Is response similar to HER2-positive or HER2-negative tumors? J. Clin. Oncol. 2016; 34 (Suppl. 15): 612. doi: 10.1200/JCO.2016.34.15_suppl.612.Landmann A., Farrugia D.J., Diego E., Bonaventura M., Soran A., Johnson R., Dabbs D.J., Clark B., Brufsky A., Davidson N.E., Lembersky B.C., Jankowitz R.C., Puhalla S., Ahrendt G.M., McAuliffe P.F., Bhargava R. HER2 equivocal breast cancer and neoadjuvant therapy: Is response similar to HER2-positive or HER2-negative tumors? J. Clin. Oncol. 2016; 34 (Suppl. 15): 612. doi: 10.1200/JCO.2016.34.15_suppl.612.Lipinski K.A., Barber L.J., Davies M.N., Ashenden M., Sottoriva A., Gerlinger M. Cancer Evolution and the Limits of Predictability in Precision Cancer Medicine. Trends Cancer. 2016; 2 (1): 49–63. doi: 10.1016/j.trecan.2015.11.003.Lipinski K.A., Barber L.J., Davies M.N., Ashenden M., Sottoriva A., Gerlinger M. Cancer Evolution and the Limits of Predictability in Precision Cancer Medicine. Trends Cancer. 2016; 2 (1): 49–63. doi: 10.1016/j.trecan.2015.11.003.Marotta M., Onodera T., Johnson J. Budd G.T., Watanabe T., Cui X., Giuliano A.E., Niida A., Tanaka H. Palindromic amplification of the ERBB2 oncogene in primary HER2-positive breast tumors. Sci. Rep. 2017; 7: 41921. doi: 10.1038/srep41921.Marotta M., Onodera T., Johnson J. Budd G.T., Watanabe T., Cui X., Giuliano A.E., Niida A., Tanaka H. Palindromic amplification of the ERBB2 oncogene in primary HER2-positive breast tumors. Sci. Rep. 2017; 7: 41921. doi: 10.1038/srep41921.Martelotto L., Ng C.K., Piscuoglio S., Weigelt B., Reis-Filho J.S. Breast cancer intra-tumor heterogeneity. Breast Cancer Res. 2014; 16: 210. doi: 10.1186/bcr3658.Martelotto L., Ng C.K., Piscuoglio S., Weigelt B., Reis-Filho J.S. Breast cancer intra-tumor heterogeneity. Breast Cancer Res. 2014; 16: 210. doi: 10.1186/bcr3658.McGranahan N., Swanton C. Clonal heterogeneity and tumor evolution: past, present, and the future. Cell. 2017; 168 (4): 613–628. doi: 10.1016/j.cell.2017.01.018.McGranahan N., Swanton C. Clonal heterogeneity and tumor evolution: past, present, and the future. Cell. 2017; 168 (4): 613–628. doi: 10.1016/j.cell.2017.01.018.Murray C., D’Arcy C., Gullo G., Flanagan L., Quinn C.M. Human epidermal growth factor receptor 2 testing by fluorescent in situ hybridization: positive or negative? ASCO/College of American Pathologists guidelines 2007, 2013, and 2018. Arch. Pathol. Lab. Med. 2019; 143 (4): 412–413. doi: 10.5858/arpa.2018-0905-LE.Murray C., D’Arcy C., Gullo G., Flanagan L., Quinn C.M. Human epidermal growth factor receptor 2 testing by fluorescent in situ hybridization: positive or negative? ASCO/College of American Pathologists guidelines 2007, 2013, and 2018. Arch. Pathol. Lab. Med. 2019; 143 (4): 412–413. doi: 10.5858/arpa.2018-0905-LE.Ng C.K., Martelotto L.G., Gauthier A., Wen H.C., Piscuoglio S., Lim R.S., Cowell C.F., Wilkerson P.M., Wai P., Rodrigues D.N., Arnould L., Geyer F.C., Bromberg S.E., Lacroix-Triki M., Penault-Llorca F., Giard S., Sastre-Garau X., Natrajan R., Norton L., Cottu P.H., Weigelt B., Vincent-Salomon A., Reis-Filho J.S. Intra-tumor genetic heterogeneity and alternative driver genetic alterations in breast cancers with heterogeneous HER2 gene amplification. Genome Biol. 2015; 16 (1): 107. doi: 10.1186/s13059-015-0657-6.Ng C.K., Martelotto L.G., Gauthier A., Wen H.C., Piscuoglio S., Lim R.S., Cowell C.F., Wilkerson P.M., Wai P., Rodrigues D.N., Arnould L., Geyer F.C., Bromberg S.E., Lacroix-Triki M., Penault-Llorca F., Giard S., Sastre-Garau X., Natrajan R., Norton L., Cottu P.H., Weigelt B., Vincent-Salomon A., Reis-Filho J.S. Intra-tumor genetic heterogeneity and alternative driver genetic alterations in breast cancers with heterogeneous HER2 gene amplification. Genome Biol. 2015; 16 (1): 107. doi: 10.1186/s13059-015-0657-6.Nitta H., Kelly B.D., Allred C., Jewell S., Banks P., Dennis E., Grogan T.M. The assessment of HER2 status in breast cancer: the past, the present, and the future. Pathology Int. 2016; 66: 313–324 doi: 10.1111/pin.12407.Nitta H., Kelly B.D., Allred C., Jewell S., Banks P., Dennis E., Grogan T.M. The assessment of HER2 status in breast cancer: the past, the present, and the future. Pathology Int. 2016; 66: 313–324 doi: 10.1111/pin.12407.Pekar G., Kasselaki I., Pekar-Lukacs A., Dekany C., Hellberg D., Tot T. Equivocal (HER2 IHC 2+) breast carcinomas: gene-protein assay testing reveals association between genetic heterogeneity, individual cell amplification status and potential treatment benefits. Histopathology. 2019; 74 (2): 300–310. doi: 10.1111/his.13733.Pekar G., Kasselaki I., Pekar-Lukacs A., Dekany C., Hellberg D., Tot T. Equivocal (HER2 IHC 2+) breast carcinomas: gene-protein assay testing reveals association between genetic heterogeneity, individual cell amplification status and potential treatment benefits. Histopathology. 2019; 74 (2): 300–310. doi: 10.1111/his.13733.Rye I.H., Trinh A., Saetersdal A.B., Nebdal D., Lingjaerde O.C., Almendro V., Polyak K., Børresen-Dale A.L., Helland Å., Markowetz F., Russnes H.G. Intratumor heterogeneity defines treatment-resistant HER2+ breast tumors. Mol. Oncol. 2018; 12 (11): 1838–1855. doi: 10.1002/1878-0261.12375.Rye I.H., Trinh A., Saetersdal A.B., Nebdal D., Lingjaerde O.C., Almendro V., Polyak K., Børresen-Dale A.L., Helland Å., Markowetz F., Russnes H.G. Intratumor heterogeneity defines treatment-resistant HER2+ breast tumors. Mol. Oncol. 2018; 12 (11): 1838–1855. doi: 10.1002/1878-0261.12375.Sapino A., Maletta F., Verdun di Cantogno L., Macri L., Botta C., Gugliotta P., Scalzo M.S., Annaratone L., Balmativola D., Pietribiasi F., Bernardi P., Arisio R., Viberti L., Guzzetti S., Orlassino R., Ercolani C., Mottolese M., Viale G., Marchio C. Gene status in HER2 equivocal breast carcinomas: impact of distinct recommendations and contribution of a polymerase chain reaction-based method. Oncologist. 2014; 19 (11): 1118–1126. doi: 10.1634/theoncologist.2014-0195.Sapino A., Maletta F., Verdun di Cantogno L., Macri L., Botta C., Gugliotta P., Scalzo M.S., Annaratone L., Balmativola D., Pietribiasi F., Bernardi P., Arisio R., Viberti L., Guzzetti S., Orlassino R., Ercolani C., Mottolese M., Viale G., Marchio C. Gene status in HER2 equivocal breast carcinomas: impact of distinct recommendations and contribution of a polymerase chain reaction-based method. Oncologist. 2014; 19 (11): 1118–1126. doi: 10.1634/theoncologist.2014-0195.Seol H., Lee H.J., Choi Y., Lee H.E., Kim Y.J., Kim J.H., Kang E., Kim S.W., Park S.Y. Intratumoral heterogeneity of HER2 gene amplification in breast cancer: its clinicopathological significance. Mod. Pathol. 2012; 25: 938–948.Seol H., Lee H.J., Choi Y., Lee H.E., Kim Y.J., Kim J.H., Kang E., Kim S.W., Park S.Y. Intratumoral heterogeneity of HER2 gene amplification in breast cancer: its clinicopathological significance. Mod. Pathol. 2012; 25: 938–948.Sorlie T. The impact of gene expression patterns in breast cancer. Clin. Chem. 2016; 62 (8): 1150–1151. doi: 10.1373/clinchem.2015.253229.Sorlie T. The impact of gene expression patterns in breast cancer. Clin. Chem. 2016; 62 (8): 1150–1151. doi: 10.1373/clinchem.2015.253229.Turashvili G., Brogi E. Tumor heterogeneity in breast cancer. Front. Med. 2017; 4: 227. doi: 10.3389/fmed.2017.00227.Turashvili G., Brogi E. Tumor heterogeneity in breast cancer. Front. Med. 2017; 4: 227. doi: 10.3389/fmed.2017.00227.Velloso F.J., Bianco A.F., Farias J.O., Torres N.E., Ferruzo P.Y., Anschau V., Jesus-Ferreira H.C., Chang T., Sogayar M.C., Zerbini L.F., Correa R.G. The crossroads of breast cancer progression: insights into the modulation of major signaling pathways. Onco Targets Ther. 2017; 10: 5491–5524. doi: 10.2147/OTT.S142154.Velloso F.J., Bianco A.F., Farias J.O., Torres N.E., Ferruzo P.Y., Anschau V., Jesus-Ferreira H.C., Chang T., Sogayar M.C., Zerbini L.F., Correa R.G. The crossroads of breast cancer progression: insights into the modulation of major signaling pathways. Onco Targets Ther. 2017; 10: 5491–5524. doi: 10.2147/OTT.S142154.Wolff A.C., Hammond M.E.H., Alison K.H., Harvey B.E., McShane L.M., Dowsett M. HER2 testing in breast cancer: American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists clinical practice guideline focused update summary. J. Oncol. Pract. 2018; 4 (7): 437–441. doi: 10.1200/JOP.18.00206.Wolff A.C., Hammond M.E.H., Alison K.H., Harvey B.E., McShane L.M., Dowsett M. HER2 testing in breast cancer: American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists clinical practice guideline focused update summary. J. Oncol. Pract. 2018; 4 (7): 437–441. doi: 10.1200/JOP.18.00206.Wu Y., Wu K., Chen Z., Zheng W., Zhang L., Yu Y., Su D., Liu S., Sheng Y. Genetic heterogeneity of HER2/Neu in breast carcinoma: a meta analysis. Int. J. Clin. Exp. Med. 2017; 10 (2): 1900–1908.Wu Y., Wu K., Chen Z., Zheng W., Zhang L., Yu Y., Su D., Liu S., Sheng Y. Genetic heterogeneity of HER2/Neu in breast carcinoma: a meta analysis. Int. J. Clin. Exp. Med. 2017; 10 (2): 1900–1908.Yang L., Zhang Z., Li J., Chen M., Yang J., Fu J., Bu H., Tang S., Liu Y., Li H., Li X., Xu F., Teng X., Yang Y., Ma Y., Guo S., Wang J., Guo D. A decision tree-based prediction model for fluorescence in situ hybridization HER2 gene status in HER2 immunohistochemistry-2+ breast cancers: a 2538-case multicenter study on consecutive surgical specimens. J. Cancer. 2018; 9 (13): 2327–2333. doi: 10.7150/jca.25586.Yang L., Zhang Z., Li J., Chen M., Yang J., Fu J., Bu H., Tang S., Liu Y., Li H., Li X., Xu F., Teng X., Yang Y., Ma Y., Guo S., Wang J., Guo D. A decision tree-based prediction model for fluorescence in situ hybridization HER2 gene status in HER2 immunohistochemistry-2+ breast cancers: a 2538-case multicenter study on consecutive surgical specimens. J. Cancer. 2018; 9 (13): 2327–2333. doi: 10.7150/jca.25586.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.