sibmedСибирский научный медицинский журналСибирский научный медицинский журнал2410-25122410-2520ИЦиГ СО РАН10.15372/SSMJ20190402sibmed-203Research ArticleМЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИBIOMEDICINEИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМА СПЕЦИФИЧНОЙ ЭНДОТЕЛИОТОКСИЧНОСТИ КАЛЬЦИЙ-ФОСФАТНЫХ БИОНОВLYSOSOME-DEPENDENT CELL DEATH DEFINES SPECIFIC ENDOTHELIAL TOXICITY OF CALCIUM PHOSPHATE BIONShttps://orcid.org/0000-0002-1518-3888ШишковаД. К.ShishkovaD. K.

650002, г. Кемерово, Сосновый бульвар, 6

650002, Kemerovo, Sosnovy blvd., 6

shishkovadk@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-1079-1956ВеликановаЕ. А.VelikanovaE. A.

к.б.н., 

650002, г. Кемерово, Сосновый бульвар, 6

candidate of biological sciences

650002, Kemerovo, Sosnovy blvd., 6

telella@mail.ruМухамадияровР. А.MukhamadiyarovR. A.

к.б.н., https://orcid.org/0000-0002-1263-1158

650002, г. Кемерово, Сосновый бульвар, 6

candidate of biological sciences

650002, Kemerovo, Sosnovy blvd., 6

rem57@rambler.ruhttps://orcid.org/0000-0001-7454-6653ЮжалинА. Е.YuzhalinA. E.

к.м.н., 

650002, г. Кемерово, Сосновый бульвар, 6

candidate of medical sciences

650002, Kemerovo, Sosnovy blvd., 6

yuzhalin@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-6134-7468КудрявцеваЮ. А.KudryavtsevaYu. A.

д.б.н.,

650002, г. Кемерово, Сосновый бульвар, 6

doctor of biological sciences

650002, Kemerovo, Sosnovy blvd., 6

jackie1970@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0001-6970-9542ПоповаА. Н.PopovaA. N.

к.х.н.,

650000, г. Кемерово, просп. Советский, 18

candidate of chemical sciences

650000, Kemerovo, Sovetsky av., 18

h991@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0001-5170-7530РуссаковД. М.RussakovD. M.

650000, г. Кемерово, ул. Красная, 6

650000, Kemerovo, Krasnaya str., 6

dm.russakov@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0001-8679-4857КутихинА. Г.KutikhinA. G.

к.м.н., 

650002, г. Кемерово, Сосновый бульвар, 6

candidate of medical sciences

650002, Kemerovo, Sosnovy blvd., 6

antonkutikhin@gmail.comНИИ комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеванийРоссияResearch Institute for Complex Issues of Cardiovascular DiseasesRussian FederationИнститут углехимии и химического материаловедения ФИЦ угля и углехимии СО РАНРоссияInstitute of Coal Сhemistry and Material Science, Federal Research Center of Coal and Coal Chemistry of SB RASRussian FederationКемеровский государственный университетРоссияKemerovo State UniversityRussian Federation2019040920193941221Copyright © Шишкова Д.К., Великанова Е.А., Мухамадияров Р.А., Южалин А.Е., Кудрявцева Ю.А., Попова А.Н., Руссаков Д.М., Кутихин А.Г., 20192019Шишкова Д.К., Великанова Е.А., Мухамадияров Р.А., Южалин А.Е., Кудрявцева Ю.А., Попова А.Н., Руссаков Д.М., Кутихин А.Г.Shishkova D.K., Velikanova E.A., Mukhamadiyarov R.A., Yuzhalin A.E., Kudryavtseva Y.A., Popova A.N., Russakov D.M., Kutikhin A.G.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://sibmed.elpub.ru/jour/article/view/203

Цель работы – идентифицировать механизм специфичной токсичности кальций-фосфатных бионов (КФБ) для эндотелия. Материал и методы. Искусственно синтезированные путем перенасыщения культуральной среды соответствующими солями КФБ и магний-фосфатные бионы (МФБ) были добавлены к культурам эндотелиальных клеток человека линии EA.hy 926 и эндотелиальных клеток мыши линии 2H-11 с целью изучения пространственно-временных аспектов интернализации бионов эндотелиальными клетками методами просвечивающей электронной и конфокальной микроскопии, анализа влияния блокады вакуолярной H+-АТФазы при помощи лизосомального ингибитора бафиломицина A1 на эндотелиотоксичность бионов, а также оценки экспрессии каспазы-3 и ее субстрата поли(АДФ-рибоза)-полимеразы (PARP-1). Результаты. КФБ поглощались эндотелиальными клетками уже через 1 ч после их добавления и были локализованы в лизосомах; спустя 4 ч наблюдалось выделение ионов кальция из лизосом в цитозоль, сопровождавшееся многократным повышением концентрации каспазы-3 и ее субстрата PARP-1. Добавление в культуральную среду бафиломицина A1 позволяло эндотелиальным клеткам избежать индуцируемой малорастворимыми КФБ гибели независимо от его дозы и времени экспозиции, при этом высокорастворимые МФБ не обладали эндотелиотоксичностью независимо от добавления бафиломицина A1. Заключение. Поглощаясь эндотелиальными клетками, КФБ инициируют их гибель вследствие своего растворения в лизосомах и последующего выделения в цитозоль ионов кальция, опосредованно активирующих каспазы. В свою очередь, МФБ не обладают эндотелиотоксичностью, поскольку при их растворении в лизосомах не происходит выделения ионов кальция. Таким образом, механизмом специфичной эндотелиотоксичности КФБ является лизосомально-опосредованная клеточная гибель.

Aim of the study was to identify the mechanism of specific endothelial toxicity related to calcium phosphate bions (CPB). Material and methods. CPB and magnesium phosphate bions (MPB) were artificially synthesised through supersaturation of culture medium with respective salts and then added to human endothelial cells (EA.hy 926) and murine endothelial cells (2H-11) to study: 1) spatiotemporal aspects of bion internalisation by means of transmission electron microscopy and confocal microscopy; 2) whether blocking of H+-ATPase by lysosomal inhibitor bafilomycin A1 affects endothelial toxicity of bions; 3) expression of caspase-3 and its substrate poly(ADP-ribose) polymerase (PARP-1). Results. CPB were internalized by endothelial cells as early as 1 h upon their addition and were localized in lysosomes; after 4 h, we detected release of calcium ions (Ca2+) from lysosomes to cytosol accompanied by multifold increase in cleaved caspase 3 and its substrate PARP-1. Bafilomycin A1 rescued endothelial cells from death induced by slightly soluble CPB regardless of exposure time and dose; however, freely soluble MPB did not evince endothelial toxicity regardless of bafilomycin A1 addition. Conclusion. Upon internalization by endothelial cells, CPB cause their death due to dissolution in lysosomes and subsequent release of calcium ions into the cytosol, ultimately leading to cleavage of executioner caspases. MPB lack endothelial toxicity because their dissolution does not lead to release of calcium ions. Therefore, specific endothelial toxicity of CPB is defined by lysosome-dependent cell death.

бионыфосфат кальциягидроксиапатиттоксичностьэндотелийлизосомыклеточная гибельатеросклерозbionscalcium phosphatehydroxyapatitetoxicityendotheliumlysosomescell deathatherosclerosisРабота выполнена при поддержке Комплексной программы фундаменталь- ных научных исследований СО РАН в рамках фундаментальной темы НИИ комплексных проблем сердечно- сосудистых заболеваний № 0546-2015-0011 «Патогенетическое обоснование разработки имплантатов для сер- дечно-сосудистой хирургии на основе биосовместимых материалов, с реализацией пациент-ориентированного подхода с использованием математического моделирования, тканевой инженерии и геномных предикторов».This study was supported by the complex program of SB RAS within the Basic Research Topic of Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases No. 0546-2015-0011 «Pathogenetic basis for the development of cardiovascular implants from biocompatible materials using patient-oriented approach, mathematical modeling, tissue engineering, and genomic predictors».ReferencesКутихин А.Г., Синицкий М.Ю., Понасенко А.В. Роль мутагенеза в развитии атеросклероза. Комплекс. проблемы серд.-сосуд. заболеваний. 2017; (1): 92–101.Kutikhin A.G., Sinitsky M.Yu., Ponasenko A.V. The role of mutagenesis in atherosclerosis. Kompleksnye problemy serdechno-sosudistykh zabolevaniy = Complex Issues of Cardiovascular Diseases. 2017; (1): 92–101. [In Russian].Шишкова Д.К., Великанова Е.А., Кривкина Е.О., Миронов А.В., Кудрявцева Ю.А., Кутихин А.Г. Кальций-фосфатные бионы специфично индуцируют гипертрофию поврежденной интимы у крыс. Рос. кардиол. журн. 2018; 23 (9): 33–38.Shishkova D.K., Velikanova E.A., Krivkina E.O., Mironov A.V., Kudryavtseva Yu.A., Kutikhin A.G. Calcium-phosphate bions do specifically induce hypertrophy of damaged intima in rats. Rossiyskiy kardiologicheskiy zhurnal = Russian Journal of Cardiology. 2018; 23 (9): 33–38. [In Russian].Шишкова Д.К., Великанова Е.А., Кривкина Е.О., Миронов А.В., Кудрявцева Ю.А., Кутихин А.Г. Токсическое действие кальций-фосфатных бионов на адвентицию брюшной аорты крыс. Атеросклероз и дислипидемии. 2018; (3): 37–43.Shishkova D.K., Velikanova E.A., Krivkina E.O., Mironov A.V., Kudryavtseva Yu.A., Kutikhin A.G. Toxicity of calcium phosphate bions for aortic adventitia in rats. Ateroskleroz i dislipidemii = The Journal of Atherosclerosis and Dyslipidemias. 2018; 3: 37–43. [In Russian].Bowman E.J., Siebers A., Altendorf K. Bafilomycins: a class of inhibitors of membrane ATPases from microorganisms, animal cells, and plant cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988; 85 (21): 7972–7976.Bowman E.J., Siebers A., Altendorf K. Bafilomycins: a class of inhibitors of membrane ATPases from microorganisms, animal cells, and plant cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988; 85 (21): 7972–7976.Ewence A.E., Bootman M., Roderick H.L., Skepper J.N., McCarthy G., Epple M., Neumann M., Shanahan C.M., Proudfoot D. Calcium phosphate crystals induce cell death in human vascular smooth muscle cells: a potential mechanism in atherosclerotic plaque destabilization. Circ. Res. 2008; 103 (5): e28–e34.Ewence A.E., Bootman M., Roderick H.L., Skepper J.N., McCarthy G., Epple M., Neumann M., Shanahan C.M., Proudfoot D. Calcium phosphate crystals induce cell death in human vascular smooth muscle cells: a potential mechanism in atherosclerotic plaque destabilization. Circ. Res. 2008; 103 (5): e28–e34.Foley R.N., Collins A.J., Ishani A., Kalra P.A. Calcium-phosphate levels and cardiovascular disease in community-dwelling adults: the Atherosclerosis Risk in Communities (ARIC) Study. Am. Heart J. 2008; 156 (3): 556–563.Foley R.N., Collins A.J., Ishani A., Kalra P.A. Calcium-phosphate levels and cardiovascular disease in community-dwelling adults: the Atherosclerosis Risk in Communities (ARIC) Study. Am. Heart J. 2008; 156 (3): 556–563.Galluzzi L., Vitale I., Aaronson S.A., Abrams J.M., Adam D., Agostinis P., Alnemri E.S., Altucci L., Amelio I., Andrews D.W., Annicchiarico-Petruzzelli M., Antonov A.V., Arama E., Baehrecke E.H., Barlev N.A., Bazan N.G., Bernassola F., Bertrand M.J.M., Bianchi K., Blagosklonny M.V., Blomgren K., Borner C., Boya P., Brenner C., Campanella M., Candi E., Carmona-Gutierrez D., Cecconi F., Chan F.K., Chandel N.S., Cheng E.H., Chipuk J.E., Cidlowski J.A., Ciechanover A., Cohen G.M., Conrad M., Cubillos-Ruiz J.R., Czabotar P.E., D’Angiolella V., Dawson T.M., Dawson V.L., de Laurenzi V., de Maria R., Debatin K.M., de Berardinis R.J., Deshmukh M., di Daniele N., di Virgilio F., Dixit V.M., Dixon S.J., Duckett C.S., Dynlacht B.D., El-Deiry W.S., Elrod J.W., Fimia G.M., Fulda S., García-Sáez A.J., Garg A.D., Garrido C., Gavathiotis E., Golstein P., Gottlieb E., Green D.R., Greene L.A., Gronemeyer H., Gross A., Hajnoczky G., Hardwick J.M., Harris I.S., Hengartner M.O., Hetz C., Ichijo H., Jäättelä M., Joseph B., Jost P.J., Juin P.P., Kaiser W.J., Karin M., Kaufmann T., Kepp O., Kimchi A., Kitsis R.N., Klionsky D.J., Knight R.A., Kumar S., Lee S.W., Lemasters J.J., Levine B., Linkermann A., Lipton S.A., Lockshin R.A., López-Otín C., Lowe S.W., Luedde T., Lugli E., MacFarlane M., Madeo F., Malewicz M., Malorni W., Manic G., Marine J.C., Martin S.J., Martinou J.C., Medema J.P., Mehlen P., Meier P., Melino S., Miao E.A., Molkentin J.D., Moll U.M., Muñoz-Pinedo C., Nagata S., Nuñez G., Oberst A., Oren M., Overholtzer M., Pagano M., Panaretakis T., Pasparakis M., Penninger J.M., Pereira D.M., Pervaiz S., Peter M.E., Piacentini M., Pinton P., Prehn J.H.M., Puthalakath H., Rabinovich G.A., Rehm M., Rizzuto R., Rodrigues C.M.P., Rubinsztein D.C., Rudel T., Ryan K.M., Sayan E., Scorrano L., Shao F., Shi Y., Silke J., Simon H.U., Sistigu A., Stockwell B.R., Strasser A., Szabadkai G., Tait S.W.G., Tang D., Tavernarakis N., Thorburn A., Tsujimoto Y., Turk B., Vanden Berghe T., Vandenabeele P., Vander Heiden M.G., Villunger A., Virgin H.W., Vousden K.H., Vucic D., Wagner E.F., Walczak H., Wallach D., Wang Y., Wells J.A., Wood W., Yuan J., Zakeri Z., Zhivotovsky B., Zitvogel L., Melino G., Kroemer G. Molecular mechanisms of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018. Cell Death Differ. 2018; 25 (3): 486–541.Julien O., Wells J.A. Caspases and their substrates. Cell Death Differ. 2017; 24 (8): 1380–1389.Julien O., Wells J.A. Caspases and their substrates. Cell Death Differ. 2017; 24 (8): 1380–1389.Kumar S., Kasseckert S., Kostin S., Abdallah Y., Schafer C., Kaminski A., Reusch H.P., Piper H.M., Steinhoff G., Ladilov Y. Ischemic acidosis causes apoptosis in coronary endothelial cells through activation of caspase-12. Cardiovasc. Res. 2007; 73 (1): 172–180.Kumar S., Kasseckert S., Kostin S., Abdallah Y., Schafer C., Kaminski A., Reusch H.P., Piper H.M., Steinhoff G., Ladilov Y. Ischemic acidosis causes apoptosis in coronary endothelial cells through activation of caspase-12. Cardiovasc. Res. 2007; 73 (1): 172–180.Kutikhin A.G., Velikanova E.A., Mukhamadiyarov R.A., Glushkova T.V., Borisov V.V., Matveeva V.G., Antonova L.V., Filipev D.E., Golovkin A.S., Shishkova D.K., Burago A.Y., Frolov A.V., Dolgov V.Y., Efimova O.S., Popova A.N., Malysheva V.Y., Vladimirov A.A., Sozinov S.A., Ismagilov Z.R., Russakov D.M., Lomzov A.A., Pyshnyi D.V., Gutakovsky A.K., Zhivodkov Y.A., Demidov E.A., Peltek S.E., Dolganyuk V.F., Babich O.O., Grigoriev E.V., Brusina E.B., Barbarash O.L., Yuzhalin A.E. Apoptosismediated endothelial toxicity but not direct calcification or functional changes in anti-calcification proteins defines pathogenic effects of calcium phosphate bions. Sci. Rep. 2016; 6: 27255.Kutikhin A.G., Velikanova E.A., Mukhamadiyarov R.A., Glushkova T.V., Borisov V.V., Matveeva V.G., Antonova L.V., Filipev D.E., Golovkin A.S., Shishkova D.K., Burago A.Y., Frolov A.V., Dolgov V.Y., Efimova O.S., Popova A.N., Malysheva V.Y., Vladimirov A.A., Sozinov S.A., Ismagilov Z.R., Russakov D.M., Lomzov A.A., Pyshnyi D.V., Gutakovsky A.K., Zhivodkov Y.A., Demidov E.A., Peltek S.E., Dolganyuk V.F., Babich O.O., Grigoriev E.V., Brusina E.B., Barbarash O.L., Yuzhalin A.E. Apoptosismediated endothelial toxicity but not direct calcification or functional changes in anti-calcification proteins defines pathogenic effects of calcium phosphate bions. Sci. Rep. 2016; 6: 27255.Larsson T.E., Olauson H., Hagström E., Ingelsson E., Arnlöv J., Lind L., Sundström J. Conjoint effects of serum calcium and phosphate on risk of total, cardiovascular, and noncardiovascular mortality in the community. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2010; 30 (2): 333–339.Larsson T.E., Olauson H., Hagström E., Ingelsson E., Arnlöv J., Lind L., Sundström J. Conjoint effects of serum calcium and phosphate on risk of total, cardiovascular, and noncardiovascular mortality in the community. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2010; 30 (2): 333–339.Lind L., Skarfors E., Berglund L., Lithell H., Ljunghall S. Serum calcium: a new, independent, prospective risk factor for myocardial infarction in middle-aged men followed for 18 years. J. Clin. Epidemiol. 1997; 50 (8): 967–973.Lind L., Skarfors E., Berglund L., Lithell H., Ljunghall S. Serum calcium: a new, independent, prospective risk factor for myocardial infarction in middle-aged men followed for 18 years. J. Clin. Epidemiol. 1997; 50 (8): 967–973.Liu Z., Xiao Y., Chen W., Wang Y., Wang B., Wang G., Xu X., Tang R. Calcium phosphate nanoparticles primarily induce cell necrosis through lysosomal rupture: the origination of material cytotoxicity. J. Mater. Chem. B. 2014; 2: 3480–3489.Liu Z., Xiao Y., Chen W., Wang Y., Wang B., Wang G., Xu X., Tang R. Calcium phosphate nanoparticles primarily induce cell necrosis through lysosomal rupture: the origination of material cytotoxicity. J. Mater. Chem. B. 2014; 2: 3480–3489.Shalini S., Dorstyn L., Dawar S., Kumar S. Old, new and emerging functions of caspases. Cell Death Differ. 2015; 22 (4): 526–539.Shalini S., Dorstyn L., Dawar S., Kumar S. Old, new and emerging functions of caspases. Cell Death Differ. 2015; 22 (4): 526–539.Shyong Y.J., Wang M.H., Kuo L.W., Su C.F., Kuo W.T., Chang K.C., Lin F.H. Mesoporous hydroxyapatite as a carrier of olanzapine for longacting antidepression treatment in rats with induced depression. J. Control Release. 2017; 255: 62–72.Shyong Y.J., Wang M.H., Kuo L.W., Su C.F., Kuo W.T., Chang K.C., Lin F.H. Mesoporous hydroxyapatite as a carrier of olanzapine for longacting antidepression treatment in rats with induced depression. J. Control Release. 2017; 255: 62–72.Shyong Y.J., Wang M.H., Tseng H.C., Cheng C., Chang K.C., Lin F.H. Mesoporous hydroxyapatite as olanzapine carrier provides a long-acting effect in antidepression treatment. J. Med. Chem. 2015; 58 (21): 8463–8474.Shyong Y.J., Wang M.H., Tseng H.C., Cheng C., Chang K.C., Lin F.H. Mesoporous hydroxyapatite as olanzapine carrier provides a long-acting effect in antidepression treatment. J. Med. Chem. 2015; 58 (21): 8463–8474.Tewari M., Quan L.T., O’Rourke K., Desnoyers S., Zeng Z., Beidler D.R., Poirier G.G., Salvesen G.S., Dixit V.M. Yama/CPP32 beta, a mammalian homolog of CED-3, is a CrmA-inhibitable protease that cleaves the death substrate poly(ADPribose) polymerase. Cell. 1995; 81 (5): 801–809.Tewari M., Quan L.T., O’Rourke K., Desnoyers S., Zeng Z., Beidler D.R., Poirier G.G., Salvesen G.S., Dixit V.M. Yama/CPP32 beta, a mammalian homolog of CED-3, is a CrmA-inhibitable protease that cleaves the death substrate poly(ADPribose) polymerase. Cell. 1995; 81 (5): 801–809.Wu C.Y., Young L., Young D., Martel J., Young J.D. Bions: a family of biomimetic mineraloorganic complexes derived from biological fluids. PLoS One. 2013; 8 (9): e75501.Wu C.Y., Young L., Young D., Martel J., Young J.D. Bions: a family of biomimetic mineraloorganic complexes derived from biological fluids. PLoS One. 2013; 8 (9): e75501.Yoshimori T., Yamamoto A., Moriyama Y., Futai M., Tashiro Y. Bafilomycin A1, a specific inhibitor of vacuolar-type H+-ATPase, inhibits acidification and protein degradation in lysosomes of cultured cells. J. Biol. Chem. 1991; 266 (26): 17707–17712.Yoshimori T., Yamamoto A., Moriyama Y., Futai M., Tashiro Y. Bafilomycin A1, a specific inhibitor of vacuolar-type H+-ATPase, inhibits acidification and protein degradation in lysosomes of cultured cells. J. Biol. Chem. 1991; 266 (26): 17707–17712.Yuan Y., Liu C., Qian J., Wang J., Zhang Y. Sizemediated cytotoxicity and apoptosis of hydroxyapatite nanoparticles in human hepatoma HepG2 cells. Biomaterials. 2010; 31 (4): 730–740.Yuan Y., Liu C., Qian J., Wang J., Zhang Y. Sizemediated cytotoxicity and apoptosis of hydroxyapatite nanoparticles in human hepatoma HepG2 cells. Biomaterials. 2010; 31 (4): 730–740.Zhang C.Y., Sun X.Y., Ouyang J.M., Gui B.S. Diethyl citrate and sodium citrate reduce the cytotoxic effects of nanosized hydroxyapatite crystals on mouse vascular smooth muscle cells. Int. J. Nanomedicine. 2017; 12: 8511–8525.Zhang C.Y., Sun X.Y., Ouyang J.M., Gui B.S. Diethyl citrate and sodium citrate reduce the cytotoxic effects of nanosized hydroxyapatite crystals on mouse vascular smooth muscle cells. Int. J. Nanomedicine. 2017; 12: 8511–8525.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.