References

sibmed

Сибирский научный медицинский журнал

2410-25122410-2520

ИЦиГ СО РАН

10.15372/SSMJ20180202

sibmed-20

Research Article

МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ

BIOMEDICINE

ПОИСК ГЕННЫХ МУТАЦИЙ ПРИ МУКОВИСЦИДОЗЕ У ДЕТЕЙ МЕТОДОМ АНАЛИЗА КРИВЫХ ПЛАВЛЕНИЯ

THE SEARCH FOR GENE MUTATIONS AT CYSTIC FIBROSIS IN CHILDREN BY THE METHOD OF HIGH-RESOLUTION MELTING ANALYSIS

Донников

М. Ю.

Donnikov

M. Y.

donnikov@gmail.com

Мещеряков

В. В.

Meshcheryakov

V. V.

maryvitaly@yandex.ru

Сургутский государственный университетРоссияSurgut State UniversityRussian Federation

2018

20022019

3821321

2019

Донников М.Ю., Мещеряков В.В.

Donnikov M.Y., Meshcheryakov V.V.

Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.

This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.

https://sibmed.elpub.ru/jour/article/view/20

Метод анализа кривых плавления высокого разрешения (HRMA) является перспективным для генотипирования и предварительного сканирования нуклеотидной последовательности гена трансмембранного регулятора кистозного фиброза ( CFTR ). В России данный метод пока не нашел практического применения. Целью работы явился анализ эффективности использования метода HRMA на первом этапе молекулярно-генетической диагностики муковисцидоза у детей. Материал и методы. Представлены результаты валидационного молекулярно-генетического исследования с помощью метода HRMA для 43 контрольных образцов ДНК, полученных у детей с подтвержденным диагнозом «муковисцидоз» и известными мутациями в гене CFTR . Результаты. Специфичность молекулярно-генетической диагностики муковисцидоза с осуществлением метода HRMA на первом ее этапе составила 100 %, чувствительность - 97,3 %. В двух образцах c протяженной делецией во 2-м и 3-м экзонах в гетерозиготном состоянии паттерн плавления был идентичен паттерну для «дикого» типа. Заключение. Высокая эффективность метода HRMA обосновывает возможность его внедрения в практику на первом этапе молекулярно-генетической диагностики муковисцидоза у детей для сокращения времени на проведение исследования, что в абсолютном большинстве случаев позволяет установить тип мутации в гене CFTR . Протяженные делеции/инсерции и сложные перестройки в гетерозиготном состоянии не выявляются с помощью метода HRM. Для определения подобного типа мутаций требуется методика мультиплексной амплификации проб с помощью лигирования.

High-resolution melting analysis (HRMA) is promising for preliminary scanning of the nucleotide sequence of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene ( CFTR ), which mutations are responsible for the development of cystic fibrosis. In Russia this method has not yet found practical application. The aim of this work was the analysis of the efficiency of the HRMA method at the first stage of molecular diagnostics of cystic fibrosis in children. Materials and methods. In order to validate the new technique for extended molecular genetic analysis we examined 43 control DNA samples obtained from children with confirmed cystic fibrosis diagnosis and known CFTR mutations. Results. The specificity of cystic fibrosis molecular diagnostics with the implementation of the HRMA method was 100 %, the sensitivity was 97.3 %. In two samples with extended heterozygous deletion of the 2nd and 3rd exons melting patterns were identical to the wild type ones. Conclusions. The high efficiency of the HRMA method proves the possibility of its usefulness in clinical practice at the first stage of cystic fibrosis molecular diagnostics in children toward the reduction of the diagnostic search duration. In most cases this method allows to determine CFTR gene mutation type. Long deletions/insertions and complex heterozygous restructurings still cannot be detected using HRMA. Multiplex ligation-dependent probe amplification is required to determine this mutation type.

молекулярная диагностикаанализ кривых плавления высокого разрешениямуковисцидоздети

References1

Красовский С.А., Каширская Н.Ю., Черняк А.В., Амелина Е.Л., Петрова Н.В., Поляков А.В., Кондратьева Е.И., Воронкова А.Ю., Усачева М.В., Адян Т.А., Степанова А.А., Алимова И.Л., Ашерова И.К., Байкова Г.В., Басилая А.В., Бойцова Е.В., Борисов А.В., Брисин В.Ю., Васильева Е.А., Васильева Т.Г., Водовозова Э.В., Воронин С.В., Гаймоленко И.Н., Голубцова О.И., Горинова Ю.В., Назаренко Л.П., Одинокова О.Н., Гембицкая Т.Е., Никонова В.С., Дьячкова А.А., Сергиенко Д.Ф., Енина Е.А., Ерзутова М.В., Зинченко Ю.С., Зоненко О.Г., Иванова Д.М., Ильенкова Н.А., Кадырова Д.В. Генетическая характеристика больных муковисцидозом в Российской Федерации по данным Национального регистра (2014 г.) // Пульмонология. 2016. 26. (2). 133-151.

Национальный консенсус «Муковисцидоз: определение, диагностические критерии, терапия» / ред. Е.И. Кондратьева, Н.Ю. Каширская, Н.И. Капранов. М.: Компания БОРГЕС, 2016. 205 с.

Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. М.: Медиа Сфера, 2002. 312 с.

Солдатов А.А., Авдеева Ж.И., Алпатова Н.А., Олефир Ю.В., Бондарев В.П., Лысикова С.Л. Орфанные препараты для лечения редких болезней // Сиб. науч. мед. журн. 2017. (2). 27-35.

Audrezet M.P., Dabricot A., Le Marechal C., Ferec C. Validation of high-resolution DNA melting analysis for mutation scanning of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene // J. Mol. Diag. 2008. 10. 424-434.

Bareil C., Guittard C., Altieri J.P., Templin C., Claustres M., des Georges M. Comprehensive and rapid genotyping of mutations and haplotypes in congenital bilateral absence of vas deferens and other cystic fibrosis transmembrane conductance regulator-related disorders // J. Mol. Diagn. 9. (5). 582-588.

Castellani C. CFTR2: how will it help care? // Paediatr. Respir. Rev. 2013. 14. 2-5.

Chambliss A.B., Resnick M., Petrides A.K., Clarke W.A., Marzinke M.A. Rapid screening for targeted genetic variants via high-resolution melting curve analysis // Clin. Chem. Lab. Med. 2017. 55. (4). 507-516.

Cohen T.S., Prince A. Cystic fibrosis: a mucosal immunodeficiency syndrome // Nat. Med. 2012. 18. (4). 509-519.

Chou L., Lyon E., Wittwer C.T. A comparison of high-resolution melting analysis with denaturing high-performance liquid chromatography for mutation scanning: cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene as a model // Am. J. Clin. Pathol. 2005. 124. (3). 330-338.

Fanen P., Wohlhuter-Haddad A., Hinzpetera A. Genetics of cystic fibrosis: CFTR mutation classifications toward genotype-based CF therapies // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2014. 52. 94-102.

Farrell P.M., White T.B., Ren C.L., Hempstead S.E., Accurso F., Derichs N., Howenstine M. Diagnosis of cystic fibrosis: consensus guidelines from the cystic fibrosis foundation // J. Pediatr. 2017. 181. 4-15.

Gonzalez-Bosquet J., Calcei J., Wei J.S., Garcia-Closas M., Sherman M.E., Hewitt S., Vockley J., Lissowska J., Yang H.P., Khan J., Chanock S. Detection of somatic mutations by high-resolution DNA melting (HRM) analysis in multiple cancers // PLoS One. 2011. 6. (1). e14522.

Cooper G.M., Shendure J. Needles in stacks of needles: finding disease-causal variants in a wealth of genomic data // Nat. Rev. Genet. 2011. 12. 628-640.

Herrmann M.G., Durtschi J.D., Bromley L.K., Wittwer C.T., Voelkerding K.V. Amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping: cross-platform comparison of instruments and dyes // Clin. Chem. 2006. 52. (3). 494-503.

Kerem B., Rommens J.M., Buchanan J.A., Markiewicz D., Cox T.K., Chakravarti A., Buchwald M., Tsui L.C. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis // Science. 1989. 245. (4922). 1073-1080.

Li B.S., Wang X.Y., Ma F.L., Jiang B., Song X.X., Xu A.G. Is high resolution melting analysis (HRMA) accurate for detection of human disease-associated mutations? A meta analysis // PLoS One. 2011. 6. (12). е28078.

Liew M., Pryor R., Palais R., Meadows C., Erali M., Lyon E., Wittwer C. Genotyping of single-nucleotide polymorphisms by high-resolution melting of small amplicons // Clin. Chem. 2004. 50. (7). 1156-6417.

Lim R.M., Silver A.J., Silver M.J., Borroto C., Spurrier B., Petrossian T.C., Larson J.L., Silver L.M. Targeted mutation screening panels expose systematic population bias in detection of cystic fibrosis risk // Genet. Med. 2016. 18. (2). 174-179.

Montgomery J., Wittwer C.T., Kent J., Zhou L. Scanning the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene using high-resolution DNA melting analysis // Clin. Chem. 2007. 53. (11). 1891-1898.

Montgomery J.L., Sanford L.N., Wittwer C.T. High-resolution DNA melting analysis in clinical research and diagnostics // Expert Rev. Mol. Diagn. 2010. 10. (2). 219-240.

Pagin А., Devos А., Figeac М., Truant М., Willoquaux Сh., Broly F., Lalau G. Applicability and efficiency of NGS in routine diagnosis: In-depth performance analysis of a complete workflow for CFTR mutation analysis // PLoS One. 2016. 11. (2). e014942620.

Population variation of common cystic fibrosis mutations. The Cystic Fibrosis Genetic Analysis Consortium // Hum. Mutat. 1994. 4. 167-177.

Pryor R.J., Myrick J.T., Palais R.A., Sundberg S.O., Paek J.Y., Wittwer C.T., Knight I.T. High-speed melting analysis: The effect of melting rate on small amplicon microfluidic genotyping // Clin. Chem. 2017. 63. (10). 1624-1632.

Singh R.R., Bains A., Patel K.P., Rahimi H., Barkoh B.A., Paladugu A. Detection of high-frequency and novel DNMT3A mutations in acute myeloid leukemia by high-resolution melting curve analysis // J. Mol. Diagn. 2012. 14. 336-345.

Sosnay P.R., Salinas D.B., White T.B., Ren C.L., Farrell P.M., Raraigh K.S., Girodon E., Castellani C. Applying cystic fibrosis transmembrane conductance regulator genetics and CFTR2 data to facilitate diagnoses // J. Pediatr. 2017. 181. S27-S32.

Svensson A.M. Detection of large rearrangements in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene by multiplex ligation-dependent probe amplification assay when sequencing fails to detect two disease-causing mutations // Genet. Test. Mol. Biomarkers. 2010. 14. 171-174.

Vandersteen J., Bayrak-Toydemir P., Palais R., Wittwer C.T. Identifying common genetic variants by high-resolution melting // Clin. Chem. 2007. 53. (7). 1191-1198.

Wittwer C.T., Reed G.H., Gundry C.N., Vandersteen J.G., Pryor R.J. High-resolution genotyping by amplicon melting analysis using LCGreen // Clin. Chem. 2003. 49. 853-860.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.